Sekvencování
Schopnost určit složení a pořadí nukleových kyselin v řetězci DNA nebo RNA má hluboký význam pro pochopení moderní genetiky a mnoha oblastí, které jsou nezbytné pro výzkum nemocí a lepší pochopení všech organismů. Schopnost sekvenovat nukleové kyseliny je užitečná nejen pro rozluštění genetického kódu organismu, ale také poskytuje výzkumníkům mocný nástroj, který v kombinaci s dalšími molekulárními technologiemi umožňuje snadno manipulovat se sekvencemi DNA a ověřovat tyto změny pomocí sekvenování. Vzhledem k tomu, že kódující DNA funguje jako kódovaná informace pro proteiny, mohou nyní výzkumníci na zakázku navrhovat rekombinantní proteiny, které obsahují velké množství funkčních prvků a jsou široce využívány k zodpovězení stejně velkého množství důležitých výzkumných otázek. Další činidla a návody pro celogenomové sekvenování naleznete na Sekvenování nové generace zdroj.
Sangerovo sekvenování
Dříve bylo možné pomocí metod analytické chemie určit složení nukleových kyselin. Fred Sanger a jeho kolegové však vyvinuli metody - zpočátku s využitím radioaktivně značených natrávených fragmentů a dvourozměrné frakcionace -, které umožnily získat jedny z prvních kompletních nukleových sekvencí. Pokroky v této oblasti pokračovaly po několik desetiletí a každé další zlepšení přispělo k rostoucí knihovně sekvenovaných proteinů a genomů. Mezi tato zlepšení patří separace nukleotidů podle délky pomocí gelové elektroforézy a následně kapilární elektroforézy. Navíc začlenění fluorescenčně značených nukleotidů a automatizovaná počítačová analýza každého fragmentu nukleové kyseliny, to vše nyní definuje moderní metodu Sangerova sekvenování.
Metodika sekvenování DNA
Ačkoli se metody sekvenování DNA od vzniku této technologie neustále zdokonalují, několik základních komponent je stále nezbytných a používaných moderními platformami sekvenování DNA. Příprava DNA obvykle zahrnuje izolaci a purifikaci DNA z hostitelského organismu. Další důležité složky, včetně volných bází DNA, primerů DNA, modifikovaných bází DNA obsahujících fluorescenční značky (terminátorové báze) a polymerázy DNA, se přidávají společně do jedné nádoby. Nádoba obsahující všechny tyto složky prostřednictvím řady kroků zahřívání a ochlazování vytvoří knihovnu malých sekvencí DNA vzhledem k sekvenci DNA plné délky, která je předmětem zájmu, přičemž každá z nich je zakončena fluorescenčně značenou terminátorovou bází. Nová vlákna DNA obsahující fluorescenčně značené koncové nukleotidy se oddělí podle délky, projdou kapilární trubicí a uspořádají se podle velikosti. Poté se použije laser k excitaci fluorescenční báze na každém vlákně, zatímco kamera snímá signál. Nakonec se obvykle použije počítač, který shromážděné informace sestaví do sekvence DNA v plné délce.
Související technické články
- Aminokyselinové kodonové kolo pro rychlý překlad RNA. Rychle a snadno zjistíte, která aminokyselina se překládá z vaší sekvence RNA.
- Použití lipidy modifikovaných olig MULTI-seq, protokol a průvodce řešením problémů pro PCR testy a sekvenační aplikace.
- Univerzální sekvenační primery umožňují sekvenovat inzert v plazmidech na specifických pozicích, což napomáhá molekulárně biologickému výzkumu.
- Validate CRISPR gene editing experiments easily with Sigma-Aldrich® T7E1 mismatch detection kit, ensuring successful editing.
- An ultrafiltration cartridge can be placed at the outlet of a water purification system to deliver nuclease-free ultrapure water.
- Zobrazit vše (9)
Související protokoly
- Seznamte se s kroky Sangerova sekvenování nebo s metodou ukončení řetězce a s tím, jak sekvenování DNA funguje a jak přesně číst výsledky Sangerova sekvenování pro váš výzkum.
- Zobrazit vše (2)
Další články a protokoly
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?