Hmotnostní spektrometrie proteinů
Hmotnostní spektrometrie proteinů se široce používá k analýze biologických vzorků pro objevování biomarkerů, proteomický výzkum a klinické aplikace. Ve srovnání s jinými technikami používanými pro rozsáhlou charakterizaci proteinů se hmotnostní spektrometrie stala hlavním nástrojem proteomiky na základě své přístupnosti ke komplexní analýze.
Hmotnostní spektrometrie se používá ke kvantitativní identifikaci a charakterizaci proteinů na základě jejich struktury, posttranslačních modifikací a interakcí.
- Identifikace proteinů obvykle zahrnuje chemické nebo enzymatické štěpení proteinů na peptidy, které jsou poté analyzovány hmotnostní spektrometrií a identifikovány pomocí výpočetních metod nebo sekvenování.
- Posttranslační modifikace lze identifikovat pomocí změn hmotnosti aminokyselinových zbytků. Místa modifikace lze mapovat pomocí sekvenování nebo výpočetních metod.
- Pro analýzu a profilování glykanů se používají enzymatické nebo chemické metody k uvolnění glykanových částí z glykoproteinů, po nichž následuje derivatizace uvolněných glykanů pro hmotnostní spektroskopickou analýzu.
- Proteinové interakce se určují afinitní kopurifikací specifického cílového proteinu s jakýmikoliv interagujícími proteiny nebo se studují globálněji pomocí chromatografie s vyloučením velikosti nebo iontově výměnné chromatografie před analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie.
Pro kvantitativní proteomiku lze proteiny nebo peptidy značit chemicky stabilními izotopy pomocí tandemového hmotnostního značení (TMT) a iTRAQ nebo metabolicky pomocí inkorporace značených aminokyselin (SILAC). Porovnání inkorporace těžkých a lehkých izotopů umožňuje relativní kvantifikaci pomocí korelace intenzity píků hmotnostního spektrometru s množstvím proteinů. Pro absolutní kvantifikaci lze vzorky obohatit o izotopicky značené syntetické peptidové nebo proteinové standardy pro analýzu SRM (selected reaction monitoring)
Při hmotnostní spektrometrii proteinů se hmotnosti různých proteinů a peptidů určují měřením poměru m/z (hmotnost-náboj) jejich iontů v plynné fázi. Hmotnostní spektrometry nejprve převedou molekuly bílkovin na ionty v plynné fázi pomocí iontového zdroje. Poté hmotnostní analyzátor rozdělí ionizované analyty na základě poměru m/z. Detektor pak zaznamenává počet iontů při každé hodnotě m/z. K ionizaci peptidů nebo proteinů se běžně používá MALDI a ionizace elektrosprejem (ESI).
Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF
MALDI je ionizační metoda, která využívá matrici pohlcující energii laseru ke generování iontů s minimální fragmentací molekul proteinů. Vzorek se nejprve smísí s vhodným matricovým materiálem. Poté se vzorek ozáří pulzním laserem, čímž se spustí ablace a desorpce vzorku i matricového materiálu. Molekuly analytu jsou pak před analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie ionizovány protonizací nebo deprotonizací v ablovaných plynech.
Elektrosprejová ionizační hmotnostní spektrometrie
Ionizace elektrosprejem (ESI) produkuje ionty pomocí elektrospreje, při němž se na kapalný vzorek přivádí vysoké napětí, které vytváří aerosol, generující ionty s minimální fragmentací peptidů a proteinů. Ionizace elektrosprejem se běžně používá při spojení hmotnostní spektrometrie s kapalinovou chromatografií (LC-MS), protože eluát z kapalinové chromatografie lze přivést přímo do elektrospreje pro tandemové zpracování.
Pracovní postupy
Trávení a označování
Specifické proteázy, jako je trypsin, se používají ke štěpení proteinů na malé fragmenty, které umožňují identifikaci porovnáním experimentálních spekter s teoretickými spektry z proteinových databází nebo porovnáním s běžnými standardy. Pro relativní kvantifikaci lze buněčné kultury označit metabolicky pomocí stabilních izotopů inkorporovaných podáváním aminokyselin nebo lze vzorky označit stabilními izotopy pomocí chemických metod. Spikování vzorků izotopicky značenými syntetickými peptidy umožňuje absolutní kvantifikaci pomocí analýzy SRM (selected reaction monitoring).
Kalibrace a standardizace v hmotnostní spektroskopii proteinů
Kalibrační standardy mohou sloužit jako kontrola při analýze vzorků a mohou být použity ke stanovení identity proteinů, citlivosti experimentu, účinnosti rozkladu a jako pomůcka při chromatografické separaci a kvantitativní analýze.
Chromatografická separace
Chromatografie umožňuje separovat proteiny a peptidy do lépe zpracovatelných vzorků pro analýzu. Protože více různých peptidů může mít podobné hmotnosti, HPLC se běžně používá k zabránění současného přidání peptidů s velmi podobnými nebo stejnými hmotnostmi do hmotnostního spektrometru, což zvyšuje celkový dynamický rozsah měření.
Detekce a analýza
Proteiny a peptidy jsou před detekcí a analýzou ionizovány pomocí MALDI nebo ESI. Hmotnostní analyzátor rozlišuje ionty na základě jejich hodnot m/z. Výsledné fragmentační vzory lze použít k identifikaci a vzorky lze relativně kvantifikovat vyhodnocením poměrů intenzit píků ze vzorků rozlišených izotopovým značením nebo absolutně kvantifikovat pomocí analýzy SRM se značenými vnitřními standardy.
Vyhledejte v našem vyhledávači dokumentů datové listy, certifikáty a technickou dokumentaci.
Související články
- Zjistěte více o hmotnostní spektrometrii, včetně toho, co to je, k čemu se používá a jak funguje.
- Protein-AQUA™™ offers robust targeted proteomics for quantitative studies across diverse research areas.
- Protein AQUA™ technique quantifies protein expression levels and phosphorylated peptides for various research applications.
- Standardize research with Universal and Dynamic Proteomics Standards, complex and well-characterized reference standards for mass spectrometry.
- Rapid trypsin digest kit yields reliable results in less than 2 hours for mass spectrometry analysis.
- Zobrazit vše (20)
Související protokoly
- Refinement of protein dual-labeling protocol using EnPresso® B Defined Nitrogen-free showcased by Vernalis, Ltd. for drug discovery.
- SigmaMab Antibody Drug Conjugate Mimic, is a non-toxic drug mimic utilized as a standard for mass spectrometry and high performance liquid chromatography.
- solution, 2 μg/mL in acetonitrile, analytical standard
- Explore mass spectrometry analysis of glycans for glycomic & glycoproteomic neutral & acidic glycan analysis. See a general mass spec glycan analysis procedure.
- Biomarkers play an essential role in the drug discovery and development process.
- Zobrazit vše (11)
Další články a protokoly
Jak vám můžeme pomoci
V případě jakýchkoli dotazů odešlete žádost o zákaznickou podporu
nebo se obraťte na náš tým služeb zákazníkům:
Pište custserv@sial.com
nebo volejte na +1 (800) 244-1173
Další podpora
- Chromatogram Search
Use the Chromatogram Search to identify unknown compounds in your sample.
- Kalkulačky a aplikace
Web Toolbox - vědecké výzkumné nástroje a zdroje pro analytickou chemii, vědu o živé přírodě, chemickou syntézu a materiálovou vědu.
- Customer Support Request
Zákaznická podpora včetně pomoci s objednávkami, produkty, účty a technickými problémy s webovými stránkami.
- FAQ
Explore our Frequently Asked Questions for answers to commonly asked questions about our products and services.
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?