Kroky a metoda Sangerova sekvenování

Co je to Sangerovo sekvenování?

Sangerovo sekvenování, známé také jako "metoda ukončení řetězce", je metoda pro stanovení nukleotidové sekvence DNA. Metodu vyvinul dvojnásobný nositel Nobelovy ceny Frederick Sanger se svými spolupracovníky v roce 1977, odtud také pochází název Sangerova sekvence.

Pro přehled obecné struktury DNA viz obrázek 2.

Jak funguje Sangerovo sekvenování?

Sangerovo sekvenování lze provádět ručně nebo častěji automatizovaně pomocí sekvenovacího stroje (obrázek 1). Každá z těchto metod se řídí třemi základními kroky, které jsou popsány níže.

Obrázek 1. Tři základní kroky automatizovaného Sangerova sekvenování.

Kroky Sangerova sekvenování

Sangerovo sekvenování má tři hlavní kroky.

1. Sekvence DNA pro PCR s ukončením řetězce

Zajímavá sekvence DNA se použije jako šablona pro speciální typ PCR zvaná PCR s ukončením řetězce. Řetězová terminační PCR funguje stejně jako standardní PCR, ale s jedním zásadním rozdílem: přidáním modifikovaných nukleotidů (dNTP) zvaných dideoxyribonukleotidy (ddNTP). V prodlužovacím kroku standardní PCR přidává DNA polymeráza dNTP do rostoucího vlákna DNA katalyzací tvorby fosfodiesterové vazby mezi volnou 3'-OH skupinou posledního nukleotidu a 5'-fosfátem následujícího (obrázek 2).

Při PCR s řetězovým zakončením uživatel v reakci PCR smíchá nízký poměr řetězově zakončujících ddNTP s normálními dNTP. ddNTP postrádají 3'-OH skupinu potřebnou pro tvorbu fosfodiesterové vazby; proto když polymeráza DNA náhodně začlení ddNTP, prodloužení se zastaví. Výsledkem PCR s řetězcovým zakončením jsou miliony až miliardy oligonukleotidových kopií sekvence DNA, která je předmětem zájmu, ukončených v náhodných délkách (n) pomocí 5'-ddNTP.

Při manuálním Sangerově sekvenování se připraví čtyři reakce PCR, přičemž do každé se přimíchá pouze jeden typ ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP a ddCTP).

Při automatizovaném Sangerově sekvenování jsou všechny ddNTP smíchány v jedné reakci a každý ze čtyř dNTP má jedinečnou fluorescenční značku.

2. Rozdělení podle velikosti pomocí gelové elektroforézy

V druhém kroku se oligonukleotidy zakončené řetězcem rozdělí podle velikosti pomocí gelové elektroforézy. Při gelové elektroforéze se vzorky DNA vloží na jeden konec gelové matrice a přivede se elektrický proud; DNA je záporně nabitá, takže oligonukleotidy budou taženy ke kladné elektrodě na opačné straně gelu. Protože všechny fragmenty DNA mají stejný náboj na jednotku hmotnosti, rychlost, kterou se oligonukleotidy pohybují, bude určena pouze velikostí. Čím menší je fragment, tím menší tření při pohybu gelem vzniká a tím rychleji se pohybuje. Ve výsledku budou oligonukleotidy uspořádány od nejmenšího k největšímu a budou číst gel zdola nahoru.

Při manuálním Sangerově sekvenování se oligonukleotidy z každé ze čtyř reakcí PCR spustí ve čtyřech samostatných drahách gelu. To umožňuje uživateli zjistit, které oligonukleotidy odpovídají jednotlivým ddNTP.

Při automatizovaném Sangerově sekvenování probíhají všechny oligonukleotidy v jediném kapilárním gelu elektroforézy v sekvenačním zařízení.

3. Analýza gelu & Určení sekvence DNA

Poslední krok spočívá v jednoduchém čtení gelu za účelem určení sekvence vstupní DNA. Protože DNA polymeráza syntetizuje DNA pouze ve směru 5' až 3' počínaje poskytnutým primerem, bude každý koncový ddNTP odpovídat určitému nukleotidu v původní sekvenci (např, nejkratší fragment musí končit na prvním nukleotidu od 5' konce, druhý nejkratší fragment musí končit na druhém nukleotidu od 5' konce atd.) Proto čtením gelových pásů od nejmenšího po největší můžeme určit 5' až 3' sekvenci původního vlákna DNA.

Při manuálním Sangerově sekvenování uživatel čte všechny čtyři pruhy gelu najednou, pohybuje se zdola nahoru a pomocí pruhu určuje identitu koncového ddNTP pro každý pás. Pokud se například spodní pás nachází ve sloupci odpovídajícím ddGTP, pak nejmenší fragment PCR končí ddGTP a první nukleotid od 5' konce původní sekvence má guaninovou (G) bázi.

Při automatizovaném Sangerově sekvenování čte počítač jednotlivé pásy kapilárního gelu v pořadí a pomocí fluorescence určuje identitu každého koncového ddNTP. Stručně řečeno, laser excituje fluorescenční značky v každém pásu a počítač detekuje výsledné emitované světlo. Protože každý ze čtyř ddNTP je označen jinou fluorescenční značkou, lze emitované světlo přímo spojit s identitou koncového ddNTP. Výstupem je tzv. chromatogram, který zobrazuje fluorescenční pík každého nukleotidu podél délky templátu DNA.

Obrázek 2. Schéma struktury DNA. DNA je molekula složená ze dvou vláken, která se navzájem obtáčejí a tvoří dvojitou šroubovici. Každé vlákno se skládá z řetězce molekul zvaných deoxyribonukleotidy (dNTP).

Každý dNTP obsahuje fosfátovou skupinu, cukernou skupinu a jednu ze čtyř dusíkatých bází [adenin (A), thymin (T), guanin (G) nebo cytosin (C)]. DNTP jsou lineárně spojeny kovalentními fosfodiesterovými vazbami mezi cukrem jednoho dNTP a fosfátovou skupinou dalšího; tento opakující se cukr-fosfátový vzorec tvoří cukr-fosfátovou páteř.

Dusíkaté báze dvou oddělených vláken jsou spojeny vodíkovými vazbami mezi komplementárními bázemi a tvoří dvouvláknovou šroubovici DNA.

Jak číst výsledky Sangerova sekvenování

Správné čtení výsledků Sangerova sekvenování závisí na tom, které ze dvou komplementárních vláken DNA je předmětem zájmu a jaký primer je k dispozici. Pokud jsou obě vlákna DNA A a B a předmětem zájmu je vlákno A, ale primer je lepší pro vlákno B, budou výstupní fragmenty totožné s vláknem A. Na druhou stranu, pokud je předmětem zájmu vlákno A a primer je lepší pro vlákno A, pak bude výstup totožný s vláknem B. V souladu s tím musí být výstup převeden zpět na vlákno A.

Takže pokud sekvence zájmu zní "TACG" a primer je pro toto vlákno nejlepší, výstup bude "ATGC", a proto musí být převeden zpět na "TACG". Pokud je však primer lepší pro komplementární vlákno ("ATGC"), pak bude výstupem "TACG", což je správná sekvence.

Zkrátka, než začnete, musíte vědět, na co se zaměřujete a jak se k tomu dostanete! Takže s ohledem na tuto skutečnost uvádíme příklad prvního příkladu (TACG -> ATGC -> TACG). Pokud jsou značky dideoxynukleotidů T = žlutá, A = růžová, C = tmavě modrá a G = světle modrá, získáte krátké sekvence primer-A, primer-AT, primer-ATG a primer-ATGC. Po oddělení fragmentů elektroforézou laser přečte fragmenty v pořadí podle délky (růžová, žlutá, světle modrá a tmavě modrá) a vytvoří chromatogram. Počítač převede písmena, takže výsledná sekvence je správně TACG.

Sangerovo sekvenování vs. PCR

Sangerovo sekvenování a PCR používají podobné výchozí materiály a mohou být použity ve vzájemné kombinaci, ale ani jeden z nich nemůže nahradit druhý.

PCR se používá k amplifikaci celé DNA. I když mohou náhodou vzniknout fragmenty různé délky (např. může dojít k vypadnutí polymerázy DNA), cílem je duplikovat celou sekvenci DNA. Za tímto účelem jsou "ingrediencemi" cílová DNA, nukleotidy, primer DNA a polymeráza DNA (konkrétně polymeráza Taq, která dokáže přežít vysoké teploty potřebné při PCR).

Naproti tomu cílem Sangerova sekvenování je vytvořit všechny možné délky DNA až do úplné délky cílové DNA. Proto jsou kromě výchozích materiálů pro PCR nezbytné také dideoxynukleotidy.

Sangerovo sekvenování a PCR lze při generování výchozího materiálu pro protokol Sangerova sekvenování spojit. Pomocí PCR lze vytvořit mnoho kopií DNA, která má být sekvenována.

Mít k dispozici více než jeden templát, ze kterého lze pracovat, zefektivňuje Sangerův protokol. Pokud je cílová sekvence dlouhá 1 000 nukleotidů a existuje pouze jedna kopie šablony, bude generování 1 000 označených fragmentů trvat déle. Pokud však existuje několik kopií šablony, teoreticky bude generování všech 1 000 značených fragmentů trvat kratší dobu.