Imunohistochemie

Příprava tkání IHC, získávání antigenů a předúprava

Typicky se tkáně fixují, zalijí do parafínu a pomocí mikrotomu se rozřežou pro analýzu IHC. Důležitým krokem následujícím po počáteční přípravě tkáně je nutnost získání antigenu. Ta je nutná k přerušení proteinových příčných vazeb vytvořených během fixace a k odhalení skrytých antigenních míst. Podmínky pro získání antigenu a předúpravu je třeba stanovit empiricky, protože přístupnost epitopu antigenu se může výrazně lišit v závislosti na mnoha biologických faktorech. Například některé antigeny mohou vyžadovat agresivnější předúpravu, aby se "odmaskovaly" jejich epitopy vázající protilátky, zatímco u některých antigenů nemusí být předúprava vůbec nutná. Mezi dvě běžné metody předběžné úpravy antigenů patří Heat-Induced Epitope Retrieval (HIER), kdy se používá zdroj tepla ve spojení s pufry a enzymy (proteináza K). Druhá metoda, Proteolytic-Induced Epitope Retrieval (PIER), je další metodou získávání antigenu, při níž mohou být použity různé proteázy, například proteináza K, trypsin, chymotrypsin nebo pepsin.

IHC barvení a detekce

Po přípravě tkáně a předúpravě antigen retrievalem lze vizualizovat interakci protilátka-antigen několika způsoby. Jedna z běžných metod používá primární protilátku, která je konjugována s enzymem, jako je křenová peroxidáza nebo alkalická fosfatáza, který katalyzuje barevnou reakci. Alternativou je metoda imunofluorescence (IF), při níž se používá protilátka, která je značena fluoroforem, jako je fluorescein, rhodamin nebo Alexa Fluor. Další možností je použití neznačené primární protilátky s nepřímou detekcí antigenu pomocí značené sekundární protilátky nebo složitějších detekčních systémů. V tomto případě je třeba pro každou zkoušku stanovit optimální titr primární i sekundární protilátky.