Řešení problémů s buněčnými kulturami

Buněčné kultury se staly jednou z nejzákladnějších technik pro modelování biologických systémů a mají stále větší význam v biotechnologickém a farmaceutickém odvětví a jsou také základním procesem ve výzkumných laboratořích v oblasti přírodních věd. Ačkoli je tato technika velmi dostupná, úspěšné množení buněk pro rozšíření zásob nebo modelovací experimenty může být ztíženo kontaminací nebo jinými podmínkami, které negativně ovlivňují životaschopnost buněk. Běžná praxe sdílení buněk vedla k dobře publikovaným důkazům o křížové kontaminaci buněčných zásob, jejichž identita byla dříve nezpochybnitelná. Identifikace běžných i méně častých důvodů, proč buňky neprospívají, může zvýšit efektivitu laboratoře, zvýšit výtěžnost buněčných produktů a zajistit smysluplné a spolehlivé následné údaje z modelů in vitro.      

Nesprávná identifikace buněčných linií

Podle nedávných studií se nesprávná identifikace může týkat až jedné třetiny všech používaných buněčných linií. Tato zjištění mají potenciál zpochybnit publikované poznatky o biologických systémech založené na výsledcích z modelů buněčných linií. Mezi faktory vedoucí k chybné identifikaci/křížové kontaminaci buněčných linií patří:

• Kontaminace agresivními buněčnými liniemi: Izoenzymová analýza prokázala, že mnoho buněčných linií sdílí vzácnou izoformu enzymu s buňkami HeLa. Od té doby se ukázalo, že HeLa je nejčastější invazivní buněčnou linií v kultivačních zásobách.
• Dokumentace a postupy označování: Baňky s buněčnými kulturami, destičky, kryovialy a mrazicí kontejnery musí být jasně označeny a musí být přísně vedeny mapy skladování tekutého dusíku, které odrážejí přidávání, odebírání a přemisťování buněčných zásob.
• Zapůjčování buněčných linií: Sdílení buněk mezi sousedními laboratořemi je běžnou praxí, která vede k chybám v identitě buněčných linií. Buněčné linie by měly být získávány pouze z renomovaných buněčných úložišť, jako je ECACC, European Collection of Authenticated Cell Cultures při Public Health England.

Buďte informováni o běžných příčinách křížové kontaminace buněčných linií a o tom, jak chránit svou práci před jejími následky.

Mikrobiální kontaminace buněčných kultur

Prostředí pro buněčné kultury a inkubační podmínky poskytují ideální prostředí pro buňky a bakteriální, plísňové a virové kontaminanty. Aby se zvýšila pečlivost při dodržování aseptické kultivační techniky, je třeba kultury pravidelně mikroskopicky vyšetřovat na přítomnost bakteriálních a houbových vetřelců. Některé všudypřítomné mikrobiální kontaminanty vizuální detekci unikají, odhaduje se, že až 30 % všech kultur je kontaminováno mykoplasmou. Reagencie a soupravy určené k detekci neviditelných mykoplazmat jsou často založeny na amplifikaci PCR, kterou lze použít i k detekci virových kontaminantů.

Zjistěte, jak udržet své kultury bez biologických a chemických kontaminantů.

Slabý růst buněk

Je frustrující, když buňky v kultuře, které se jinak zdají být zdravé, nedosahují konfluence. Když vyloučíme kontaminanty, mezi možné překážky zdvojení zdravých buněk patří např:

• Stav a kvalita kultivačního/mrazicího média
• Kvalita a vhodnost doplňků pro použití
• Nepřesné stanovení počtu buněk během zmrazování nebo pasáže

Když se buňky zdají být životaschopné, ale nerozvíjejí se, naučte se, co můžete udělat pro zlepšení kultivačních podmínek pro optimální růst, než se vrátíte ke kapalnému dusíku.

Oddělování fenotypů adherentních buněk

Adherentní buňky se mohou v kultuře spontánně oddělovat, a to jednotlivě nebo v plátcích. Když adherentní kultury takto nezůstanou, zjistěte, co zkontrolovat a jak obnovit soudržnost v kultuře.

Shlukování buněk

Buňky v suspenzi napodobují podmínky in vivo jako jednotlivé buňky. Když se buňky začnou shlukovat, může to být způsobeno lepkavými nukleovými kyselinami, které jsou přítomny v médiích, když jsou kultury vystaveny stresu. Co se skrývá v médiích, která mohou způsobit shlukování buněk? Zde si přečtěte více o tom, jak z kultur vyhnat shlukování.

Úmrtí buněk v kultuře

Pokud buňky v kultuře odumřou, je třeba nejprve vyloučit kontaminaci mikroorganismy. Mezi další faktory, které mohou přispívat ke špatnému stavu buněk nebo chování neodpovídajícímu fenotypu, patří např:

• Podmínky zmrazených zásob
• Počet průchodů buňkami/nadměrná koncentrace
• Stres prostředí
• Přemíra disociačních enzymů

Vhodné vybavení, kvalifikovaná činidla a odborné protokoly jsou klíčem k řešení neočekávaných výsledků buněčných kultur.

Precipitáty v kultivačních médiích

Pokud se nejedná o kontaminaci, mají částice v kultivaci často anorganické vysvětlení. Porozumějte vyváženým složkám pufru a médií a zjistěte více o udržování složek médií v suspenzi.