Lýza a extrakce proteinů

K dispozici je řada metod, jak narušit buňky a připravit jejich obsah k analýze. Obecně platí, že šetrné metody se používají v případě, že vzorek sestává ze snadno lyzovatelných kultivovaných buněk nebo krevních buněk, zatímco razantnější metody se používají pro narušení odolnějších bakteriálních nebo rostlinných buněk nebo savčích buněk usazených v pojivové tkáni.

• Lýza založená na detergentech: Lýza na bázi detergentu: Detergentní lýza je šetrná metoda, kterou lze použít pro savčí buňky, bakteriální buňky, kvasinky a rostliny. Buněčné suspenze se jemně odstředí a resuspendují v lyzačním roztoku obsahujícím detergenty, které působí na narušení buněčné membrány. Membrány se rozpustí, buňky se lyzují a uvolní se jejich obsah. Detergenty může být nutné odstranit následně, pokud překážejí analýze nebo výrobě.
• Lýza mrazem a rozmrazením: Tato metoda je použitelná pro suspenze savčích nebo bakteriálních buněk. Buněčná suspenze se rychle zmrazí pomocí kapalného dusíku. Vzorek se poté rozmrazí a resuspenduje pipetováním nebo jemným vířením v lyzačním pufru, přičemž se proces několikrát opakuje. Mezi jednotlivými cykly se vzorek odstředí a supernatant obsahující rozpustný protein se zachová.
• Osmotický šok: Jedná se o velmi šetrnou metodu, která může být dostatečná pro lýzu suspendovaných savčích nebo bakteriálních buněk bez použití detergentu. Metoda, často kombinovaná s mechanickým rozrušením, spočívá ve změně z vysokého na nízký osmotický tlak a je vhodná pro aplikace, při nichž má být lyzát následně rozdělen na subcelulární složky.
• Ultrasonizace: Tato metoda extrakce proteinů se nejčastěji používá pro buněčné suspenze. Buňky jsou narušeny vysokofrekvenčními zvukovými vlnami prostřednictvím sondy vložené do vzorku. Zvukové vlny vytvářejí oblast nízkého tlaku, což způsobuje narušení buněčných membrán.
• Mechanické metody: Bílkoviny lze z buněk a tkání extrahovat pomocí různých hrubých, ale účinných "drcení a mletí" opatření. Například buněčné membrány mohou být narušeny kapalinovými smykovými silami pomocí Dounceovy nebo Potter-Elvehjemovy homogenizace. Tkáně lze homogenizovat sekáním nebo mletím v chlazeném pufru pomocí mixéru Waring nebo homogenizátoru Polytron® . Tkáně nebo buňky lze zmrazit v tekutém dusíku a rozemlít na jemný prášek pomocí hmoždíře a tloučku s oxidem hlinitým nebo pískem. Rychlé míchání buněk jemnými skleněnými kuličkami narušuje buněčné stěny, účinné pro většinu grampozitivních a gramnegativních bakterií.
• Enzymatické trávení: Enzymatické trávení: Enzymatické metody se často používají při extrakci proteinů z bakterií, kvasinek nebo eukaryotických buněk usazených ve vláknitých tkáních, kde jsou buněčné membrány obklopeny robustní ochrannou strukturou. Enzymy nebo koktejly buněčné lýzy, jako jsou lysozym, mutanolysin, metapolyzym, lysonáza a pronáza, lze použít v kombinaci s enzymy pro trávení tkání (tj. kolagenáza, chondroitináza, hyaloronidáza) k rozpuštění nebo narušení buněčných stěn, obalů, kapsid nebo jiných struktur, které nelze snadno rozřezat pouze mechanickými metodami. Po enzymovém štěpení může následovat homogenizace, sonikace nebo intenzivní víření v lyzačním pufru.

Díky tomu, že se při rozrušení buňky mohou uvolnit endogenní proteázy a fosfatázy, které cílovou molekulu degradují, měl by být vzorek během rozrušení buňky a následné purifikace chráněn pomocí inhibitory proteáz a fosfatáz, aby se zabránilo nekontrolované ztrátě cíle.