Multiplexování vzorků MULTI-seq pro analýzu a sekvenování jednotlivých buněk

• Systém MULTI-seq a sekvenování nové generace (NGS)
• Protokol značení MULTI-seq
• Účinnost značení MULTI-seq a stabilita vzorku
• MULTI-seq a jednobuněčný RNA-Seq
• Průvodce řešením problémů s MULTI-seq
• Reagencie pro MULTI-seq a související produkty

Jednobuněčná RNA-seq (scRNA-Seq) je výkonný, ale relativně málo výkonný nástroj pro analýzu genové exprese na úrovni jedné buňky. MULTI-seq byl vyvinut pro multiplexování typů vzorků pomocí lipidy modifikovaných oligonukleotidů (LMO) komplexovaných s jedinečnými čárovými kódy vzorků DNA, což umožňuje spojit více vzorků do jednoho pracovního postupu jednobuněčné analýzy. Multiplexování vzorků snižuje související náklady a poskytuje dodatečný výkon při identifikaci artefaktů, jako jsou buněčné dublety, v aplikacích sekvenování jednotlivých buněk a sekvenování jednoho jádra (snRNA-Seq).

MULTI-seq LMO ukotvují čárové kódy vzorků DNA na buněčnou membránu nebo jaderný obal jakékoli živé buňky při zachování životaschopnosti buněk a endogenních vzorců genové exprese pro multiplexování jednotlivých buněk. Buňky nebo jádra označené MULTI-seq LMO se přímo používají pro jednobuněčné pracovní postupy, jako je například Chromium X (10x Genomics) ¹. Čárové kódy vzorků MULTI-seq jsou během přípravy odděleny od endogenních knihoven cDNA podle velikosti a mohou být sekvenovány samostatně nebo jako část endogenní knihovny cDNA. MULTI-seq je vhodný pro aplikace multiplexování primárních lidských epiteliálních buněk mléčné žlázy, kryokonzervovaných nádorů, metastatických míst izolovaných z myšího modelu xenograftu odvozeného od pacienta, mononukleárních buněk periferní krve (PBMC), ZipSeq, myší sítnice a myších plic ^2-5.

Systém MULTI-seq a sekvenování nové generace (NGS)

Systém MULTI-seq se skládá z lipidy modifikovaných kotevních olig (amid kyseliny 3'-lignocerové), ko- kotevních olig (amid kyseliny 5'-palmitové) a čárových kódů vzorků DNA (obrázek 1A-B). Kotevní oligo a čárový kód DNA specifický pro vzorek se předem smíchají, aby se umožnila hybridizace, a poté se přidají k promytým buňkám, kde hydrofobní kotevní část lokalizuje čárový kód DNA vzorku na plazmatické membrány. Následná hybridizace ko-kotvy prodlužuje retenci komplexu oligo na membráně po dobu nejméně 2 hodin v testovaných buňkách (obrázek 1C-E a obrázek 2A). Návrh čárového kódu vzorku DNA je flexibilní a lze jej optimalizovat v závislosti na platformě pro analýzu jednotlivých buněk a sadě knihovny cDNA.

Popisujeme zde postup pro zachycení čárových kódů vzorků DNA spolu s molekulami mRNA z jednotlivých buněk. Čárové kódy vzorků DNA zahrnují 3' poly-A (30 bází), čárový kód vzorku (8 bází) a 5' PCR rukojeť, která je nezbytná pro přípravu knihovny a hybridizaci kotvy (obrázek 1B). Doména 3' poly-A napodobuje endogenní transkripty, a proto se na ni vážou kuličky pro zachycení mRNA v kapénkách. Čárové kódy vzorků DNA zachycené kuličkami jsou spojeny s čárovými kódy a UMI v kapénkách, podobně jako endogenní mRNA, a jsou přenášeny přes kroky reverzní transkripce a amplifikace cDNA v běžném pracovním postupu s jednou buňkou. MULTI-seq čárové kódy vzorků (čárový kód vzorku DNA + jednobuněčný čárový kód + UMI) a endogenní cDNA jsou před konstrukcí knihovny NGS odděleny selekcí velikosti. Knihovny čárových kódů vzorků MULTI-seq se poté zkonstruují pomocí PCR, aby se přidaly adaptéry sekvence NGS, například P5 a P7 (obrázek 1F). 

Obrázek 1A. Schéma pro činidlo MULTI-seq Lipid Modified Oligos. Pár kotva/ko-kotva zakotvený v membráně a navázaný na čárový kód vzorku DNA.

Obrázek 1B. Sekvence DNA kotvy, spolukotvy a čárových kódů vzorků DNA.

Obrázek 1C. Označení MULTI-seq LMO čárovým kódem vzorku DNA. Krok 1: Smíchejte kotvu a čárový kód vzorku DNA pro hybridizaci.

Obrázek 1D. Označení MULTI-seq LMO čárovým kódem vzorku DNA. Krok 2: Zpracování směsi kotvy a čárového kódu do buněk nebo nukleáz. Inkubujte 5 minut na ledu.

Obrázek 1E. Označení MULTI-seq LMO čárovým kódem vzorku DNA. Krok 3: Zpracování směsi ko-ukotvení/čárového kódu do buněk nebo jader. Inkubujte 5 minut na ledu. Promyjte 1% BSA, aby se absorboval přebytek kotev a ko-anchorů.

Obrázek 1F. Dokončená struktura knihovny čárových kódů vzorků MULTI-seq po přidání adaptéru. Čárový kód vzorku DNA je zachycen pomocí poly(dT), mRNA a čárový kód jedné buňky a sekvence UMI jsou spojeny s čárovým kódem vzorku DNA v pracovním postupu jedné buňky. Frakce čárového kódu vzorku DNA jsou odděleny od cDNA endogenního transkriptu pomocí selekce kuliček SPRI, zatímco adaptéry NGS, jako jsou P5 a P7, jsou přidány pomocí PCR před sekvenováním. Velikost DNA knihovny bude detekována na pozici 180~200 bp.

Knihovnu čárových kódů vzorků MULTI-seq lze sekvenovat jako část endogenní knihovny cDNA nebo samostatně. Publikovaný protokol je založen na reagenční sadě Chromium Single Cell 3´ (V2 a V3) a pro konstrukci knihovny čárového kódu vzorků MULTI-seq se používá univerzální primer I5 ¹. Při použití různých jednobuněčných technologií nebo souprav pro knihovny cDNA je nutná optimalizace primerů PCR v závislosti na oligo sekvenci kuliček pro zachycení mRNA nebo souprav pro knihovny. Například při použití soupravy Nadia scRNA-seq (přístroj Nadia, Dolomite Bio) by se pro konstrukci knihovny čárových kódů vzorků MULTI-seq mělo místo univerzálního primeru I5 použít hybridní oligo New-P5-SMART PCR. Za zmínku stojí, že MULTI-seq LMO poskytují technologii pro umístění čárového kódu DNA vzorku pro multiplexování vzorků, která je flexibilní a lze ji přizpůsobit v závislosti na aplikacích.

Tabulka 1. MULTI-seq kotevní a ko-kotevní oligos jsou k dispozici společně pod katalogovým číslem LMO001. Kromě toho je možné samostatně zakoupit 96 olig s 5' koncovkami a 96 olig s 3' koncovkami unikátního čárového kódu. Podrobnosti o našem produktu s vlastním čárovým kódem, Next-Gen Sequencing Oligos (NGSO), najdete na SigmaAldrich.com/nextgenoligos podle potřeby jednotlivých aplikací. Pro minimální křížovou kontaminaci primerů s čárovým kódem si objednejte primery v kvalitě NGSO-Silver nebo nejlépe NGSO-Gold. Prostudujte si dostupné specifikace a poté zašlete žádost o cenovou nabídku na čárové kódy MULTI-seq na adresu dnaoligos@milliporesigma.com. Sekvence se neposkytují před nákupem, ale budou uvedeny v dokumentaci k výrobku při dodání.

Aplikace	Soustředění	Sekvence
MULTI-seq Kotva oligo pro značení buněk nebo jader, katalog LMO001A	50 µM	Součást sady MULTI-Seq (LMO001) - lignocerální kotva s DNA oligo
MULTI-seq Co-anchor oligo pro značení buněk nebo jader, katalog LMO001B	50 µM	Podrobný popisSoučást sady MULTI-Seq (LMO001) - palmitová ko-kotva s DNA oligo
Čárový kód vzorku s poly(A) ocáskem pro analýzu mRNA	50 µM	5′-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA- 8-bázový index-A30-3′
Vzorky čárových kódů pro 5' syntézu knihovny cDNA	50 µM	5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA- 8bázový index-CCCATATAAGAAA-3'
Čárový kód vzorku DNA značeného FAM #1	50 µM	5´CCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGAGAAG AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-FAM-3´
Primery TruSeq RPI	10 µM	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNN GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3´
Univerzální primer I5 pro uživatele reagenční soupravy Chromium Single Cell 3´	10 µM	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3´
MULTI-seq aditivní primer, použitý pro Chromium Single Cell 3´ reagenční kit (Ver.2).	10 µM	5´-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3´
New-P5-SMART PCR hybrid oligo. scRNA-Seq kit pro uživatele Nadia	10 µM	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTGT CCGCGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT*A*C-3´ * Hvězdičky označují modifikaci fosforothioátové báze

MULTI-seq Protokol značení

Příprava LMO olig a jedinečných olig s čárovým kódem vzorku:

1. Zkombinujte kotevní oligo a unikátní oligo čárového kódu vzorku každé na koncentraci 2 µM v PBS (-) (bez Ca²⁺ a Mg²⁺). 

Reagencie	1 vzorek	2 vzorky	3 vzorky	5 vzorků
Oligo kotvy (50 µM)	1 µl	Přípravek pro přípravu kotvy (50 µM)	Přípravek pro přípravu kotvy (50 µM)1 µl x 2 (2 µl)	1 µl x 3 (3 µl)	1 µl x 4 (4 µl)	1 µl x 5 (5 µl)L)
Unikátní oligo s čárovým kódem vzorku (50 µM)	1 µL	1 µL	1 µl	1 µl	1 µl
PBS (-)	23 µlL	23 µL x 2 (46 µL)	23 µL x 3 (69 µL)	23 µL x 4 (92 µL)	23 µL x 5 (115 µL)
Celkový objem	25 µL	25 µL x 2<./td>	25 µL x 3	25 µL x 4	25 µL x 5

2. Zřeďte ko-anchor na koncentraci 2 µM v PBS (-). 

Reagencie	1 vzorek	2 vzorky	3 vzorky	4 vzorky	5 vzorků
Co-Anchor oligo (50 µM)	1 µl	2 µl	3 µl	4 µl	5 µl
PBS (-)	24 µL	48 µL	72 µL	96 µL	120 µL
25 µL	50 µL	75 µL<./td>	100 µL	125 µL

3. Připravte 4 ml 1% BSA na vzorek v PBS (-) a uložte na led.

Příprava buněk:

1. Připravte suspenzi jednotlivých buněk v PBS (-). Konečná koncentrace je ~500 000 buněk ve 180 µl. Pokud PBS (-) není pro vzorky použitelný, použijte jakýkoli požadovaný pufr bez FBS nebo séra v pufru.

Poznámka: U adherentních buněk neprovádějte nadměrnou trypsinizaci. Značení oligem LMO může ovlivnit pevnost membrány v závislosti na typu buněk a nadměrně trypsinizované buňky se mohou při tvorbě kapek porušit.

Značení:

1. Do 180 µl buněčné suspenze přidejte 20 µl směsi kotvy a čárového kódu vzorku DNA a jemně promíchejte pipetováním.
2. Inkubujte 5 minut na ledu.
3. Přidejte 20 µl roztoku Co-Anchor a jemně promíchejte pipetováním.
4. Inkubujte 5 minut na ledu.
5. Přidejte 1 ml 1% BSA v PBS (-).
6. Odstřeďte buňky centrifugací. Poznámka: Neodstřeďujte při vysokých otáčkách.
7. Odstřeďte buňky 1% BSA v PBS nejméně dvakrát.
8. Resuspendujte buňky v příslušném množství 1% BSA v PBS (-) pro průtokovou cytometrii nebo ve vhodném pufru pro práci s jednotlivými buňkami.
9. Pro průtokovou cytometrii změřte FAM pozitivní frakci pro vyhodnocení účinnosti značení.

Předložení knihovny NGS

Přidání knihovny MULTI-seq v 1% molárním poměru oproti knihovně cDNA zajistí dostatečné zarovnání sekvence čárového kódu knihovny MULTI-seq.

Například spojte 0,5 µl knihovny MULTI-seq o objemu 1 ng/µl s 49,5 µl knihovny cDNA o objemu 2 ng/µl pro formát 400 milionů čtení (MULTI-seq: cDNA=1:99). Sekvence čárového kódu vzorku DNA se nachází za sekvencí poly(dT) ze strany čtení1 (obrázek 1F). podrobný protokol je zveřejněn jako doplňková data.

MULTI-seq Účinnost značení a stabilita vzorků

Pro kvantifikaci účinnosti značení a stability ve vzorcích byly lidské fibroblasty předkožky (HFF), buňky HEK293T a buňky NIH3T3 krátce označeny čárovým kódem vzorku DNA#1 značeným FAM. Jak ukazuje obrázek 2A, více než 98 % buněk bylo účinně označeno čárovým kódem vzorku DNA pomocí MULTI-seq LMO olig. Značení je stabilní minimálně 2 hodiny na ledu, zatímco účinnost značení se sníží, pokud se nepoužije ko-kotva (obrázek 2B).

Obrázek 2. Účinnost značení s čárovým kódem vzorku DNA značeného FAM#1. A) Fibroblasty lidské předkožky (HFF), buňky HEK293 a buňky NIH3T3 byly označeny kotvou LMO a ko-kotvou obsahující čárový kód vzorku DNA#1 značený FAM. Účinnost značení byla měřena průtokovou cytometrií. Pro zachycení populace buněk pozitivních na FAM byl použit kanál GFP. B) Buňky byly označeny kotvou i ko- kotvou (zelená) nebo pouze kotvou (fialová) obsahující čárový kód vzorku DNA značený FAM#1. Jako negativní kontroly byly použity buňky bez LMO olig (pouze s čárovým kódem vzorku DNA značeným FAM#1) (Oranžová). Po 1 hodině při pokojové teplotě byly průtokovou cytometrií zachyceny buňky pozitivní na FAM. Účinnost značení byla snížena ve stavu, kdy chyběla ko-kotva, což dokazuje, že pro účinné značení buněk jsou nutná obě oligos.

MULTI-seq a jednobuněčná RNA-seq

Výsledky experimentů scRNA-Seq jednotlivých uživatelů s MULTI-seq LMO jsou shrnuty na obrázcích 3 a 4. V obou experimentech fungovala činidla MULTI-seq efektivně při multiplexování vzorků & demultiplexování a rozlišování dubletů.

Obrázek 3. data experimentálních vzorků scRNA-Seq s využitím MULTI-seq LMO. PBMC byly izolovány od tří makaků rhesus a označeny fluorescenčními protilátkami (CD3/CD8/CD4). Souběžně s barvením protilátkami byl každý vzorek označen jedinečným čárovým kódem vzorku MULTI-seq podle pokynů výrobce. Vzorky byly sloučeny a CD8+ T-buňky (CD3+/CD8+/CD4-) byly roztříděny do 30uL RPMI + 10% FBS média pomocí přístroje FACS Aria. Buňky byly zpracovány na přístroji 10x Genomics s použitím chemie 5´ GEX. Čtení z knihovny buněčného hašování byla zpracována pomocí CITE-Seq-Count a volání buněčného hašování byla vytvořena pomocí algoritmu založeného na deMULTIplex. A) Značení MULTI-seq poskytuje silný signál na buňku s jasným oddělením od pozadí. B) Heatmapa využívající data z A ukazuje jasné oddělení vzorků a schopnost rozlišit singlety, doublety a negativní buňky. C) Na normalizované matici počtů byla provedena t-SNE, která ilustruje jasné shlukování podle vzorků.

Obrázek 4. Demultiplexování a kontrola kvality experimentu scRNA-seq pomocí 9 různých čárových kódů. Surová čtení čárových kódů byla transformována na log-2 a centrována na průměr a poté zpracována pomocí klasifikační sady MULTI-Seq. A) Přítomnost každého čárového kódu byla vizuálně zkontrolována provedením t-SNE na normalizované matici počtu čárových kódů. B1~B9 odpovídají každému použitému čárovému kódu. Barva označuje množství čárových kódů UMI s nízkými hodnotami v černé barvě a vysokými hodnotami v červené barvě. B) Graf t-SNE vizualizující klasifikaci buněk s čárovými kódy, s vyloučením negativních. C) Heatmap zobrazující klasifikaci čárových kódů buněk o čárových kódů vzorků na základě McGinnisova protokolu (Ref 1) jako anotace řádků.

MULTI-seq Průvodce řešením problémů

1. Vydání: Vytváření kapiček v buňkách označených MULTI-seq selhalo.
   Doporučení: Neprovádějte nadměrnou trypsinizaci u adherentních buněk. Značení oligo LMO může ovlivnit pevnost membrány v závislosti na typech buněk a nadměrně trypsinizované buňky mohou být během generování kapek porušeny. Případně použijte minimální množství činidla MULTI-Seq. V tomto protokolu je minimální množství stanoveno tak, že se použije 20 µl 2 µM každého oligosložky pro 500 000 buněk. Množství oligosložky je však možné snížit v závislosti na vzorcích. Pro citlivé vzorky doporučujeme nastavit minimální množství s čárovým kódem vzorku DNA značeným FAM#1.
2. Problém: Nízké množství knihovny čárových kódů vzorků MULTI-seq DNA:
   Doporučení: Použijte více templátu čárového kódu vzorku DNA pro PCR (až 7~14 ng čárového kódu DNA místo 3.5 ng).
3. Problém: V knihovně čárových kódů vzorků MULTI-seq se koamplifikují malé pásy (projeví se při použití většího množství templátu pro PCR):
   Doporučení: Zopakujte 1,6násobné čištění SPRI.

Odkazy

1. McGinnis CS, Patterson DM, Winkler J, Conrad DN, Hein MY, Srivastava V, Hu JL, Murrow LM, Weissman JS, Werb Z, et al. 2019. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nat Methods. 16(7):619-626. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0433-8

2. McGinnis CS, Siegel DA, Xie G, Hartoularos G, Stone M, Ye CJ, Gartner ZJ, Roan NR, Lee SA. 2021. No detectable alloreactive transcriptional responses under standard sample preparation conditions during donor-multiplexed single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells. BMC Biol. 19(1): https://doi.org/10.1186/s12915-020-00941-x

3. Hu KH, Eichorst JP, McGinnis CS, Patterson DM, Chow ED, Kersten K, Jameson SC, Gartner ZJ, Rao AA, Krummel MF. 2020. ZipSeq: barcoding for real-time mapping of single cell transcriptomes. Nat Methods. 17(8):833-843. https://doi.org/10.1038/s41592-020-0880-2

4. Weir K, Leavey P, Santiago C, Blackshaw S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility using scRNA-Seq and scATAC-Seq. JoVE.(169): https://doi.org/10.3791/62239

5. Hurskainen M, Mi?íková I, Cook DP, Andersson N, Cyr-Depauw C, Lesage F, Helle E, Renesme L, Jankov RP, Heikinheimo M, et al. Single cell transcriptomic analysis of murine lung development on hyperoxia-induced damage. Nat Commun. 12(1): https://doi.org/10.1038/s41467-021-21865-2