THIFICDNARO

Kit de síntese de cDNA de alta fidelidade Transcriptor

sufficient for 50 reactions, sufficient for 100 reactions, sufficient for 200 reactions, suitable for RT-PCR, suitable for RT-qPCR

• NACRES: NA.55
• UNSPSC Code: 41106313

Propriedades

• usage: sufficient for 100 reactions, sufficient for 200 reactions, sufficient for 50 reactions
• feature: hotstart: no
• manufacturer/tradename: Roche
• packaging: pkg of 100 reactions (05091284001), pkg of 200 reactions (05081963001), pkg of 50 reactions (05081955001)
• technique(s): RT-PCR: suitable, RT-qPCR: suitable
• input: purified RNA
• detection method: probe-based

Descrição

General description

As transcriptases reversas retrovirais comumente usadas para síntese de cDNA exibem uma maior taxa de erro que outras DNA polimerases usadas em técnicas de análise de ácidos nucleicos. Esta imprecisão causa várias trocas de bases ou mudanças da matriz de leitura (“frameshifts”), que são propagadas em reações de PCR subsequentes. Enzimas para PCR de alta fidelidade (revisão) estão disponíveis há várias anos. A nova transcriptase reversa de alta precisão da Roche é capaz também de sintetizar com alto rendimento cDNA de comprimento total.
A alta taxa de mutação é marca registrada da replicação retroviral. Isso se origina no mecanismo de replicação de genoma por transcriptase reversa codificada pelo vírus, a qual transcreve o RNA genômico do vírus em um dsDNA. Durante o processo, a transcrição reversa produz erros frequentes de replicação. Uma explicação aceita para tal imprecisão é a ausência de atividade de exonucleases de TR 3′-5′. A taxa naturalmente alta de erro das transcriptases reversas não é ideal para várias aplicações diferentes.

Mistura de enzimas de transcriptase reversa de alta fidelidade Transcriptor para RT-PCR de RNA em duas etapas de até 14 kb.

O componente central do kit de síntese de cDNA de alta fidelidade Transcriptor é a transcriptase reversa de alta fidelidade Transcriptor, uma mistura de uma transcriptase reversa recombinante e uma enzima mediadora da revisão. A sinergia entre ambas as enzimas é fundamental para a capacidade da mistura enzimática de fazer a transcrição reversa dos moldes de RNA com fidelidade 7 vezes maior em relação a outras transcriptases reversas usadas comumente.
A mistura de enzimas de transcriptase reversa de alta fidelidade Transcriptor faz a transcrição reversa de até 14 kb de modo eficiente. Devido à alta termoestabilidade de ambos os componentes enzimáticos e ao sistema de tamponamento especialmente otimizado, a transcrição reversa é possível em temperaturas de até +55 °C. Isso permite a transcrição reversa de moldes ricos em GC, com estrutura secundária alta, sem a necessidade de incluir aditivos que possam influenciar negativamente a precisão da reação de transcrição reversa.

A transcriptase reversa recombinante incluída na mistura enzimática é expressa em E. coli. A enzima tem atividade de DNA polimerase direcionada ao RNA, atividade de DNA polimerase dependente de DNA, atividade de desenrolamento e atividade de RNase H que degrada RNA em híbridos de RNA:DNA. A última evita a necessidade de realizar uma etapa adicional e demorada de incubação da RNase H após a transcrição reversa, reduzindo o tempo de reação e os custos.

O kit de síntese de cDNA de alta fidelidade Transcriptor fornece todos os reagentes necessários para reações de síntese da primeira fita de cDNA. Para fazer o preparo (priming), pode-se usar três sistemas de primers diferentes. Dois primers de síntese de cDNA são fornecidos com o kit: primers de hexâmeros aleatórios e um primer de oligonucleotídeo (dT)₁₈ ancorado. O último é projetado para se ligar no início da cauda poli(A) para gerar cDNAs de tamanho completo e para impedir o priming a partir de sítios internos da cauda poli(A). As terminações 5′ de mRNAs longos são frequentemente pouco representadas, portanto, este método de priming é preferível para a maioria das aplicações. O uso de primers hexâmeros aleatórios permite fazer o priming ao longo de todo o comprimento do RNA para representação uniforme de todas as sequências de RNA, além de permitir a transcrição reversa de RNAs que não têm cauda poli(A). O inibidor de RNase Protector termoestável (incluído no kit) protege o RNA contra degradação em altas temperaturas de reação.

Application

O kit de síntese de cDNA de alta fidelidade Transcriptor é projetado para fazer a transcrição reversa de RNA com maior fidelidade em relação a outras transcriptases reversas. O kit contém a transcriptase reversa de alta fidelidade Transcriptor, uma mistura de uma transcriptase reversa recombinante e uma enzima mediadora da revisão otimizada para RT-PCR em duas etapas, o que torna o produto ideal para:

• Clonagem de genes de interesse
• Sequenciamento de transcriptomas
• Geração de bibliotecas de cDNA com insertos grandes e de comprimento total
• Geração de análise da expressão gênica, como análise de splicing de RNA

Como o kit também é testado com os instrumentos LightCycler^® e outros instrumentos de PCR em tempo real, o produto também é ideal para aplicações de RT-PCR quantitativo que requerem alta fidelidade.
O kit contém todos os componentes para sintetizar cDNA adequado para uso direto em RT-PCR qualitativo com termocicladores convencionais ou RT-PCR quantitativo em instrumentos de PCR em tempo real. O tamanho de embalagem de 50 reações também inclui 10 reações controle (RNA controle e mistura de primers controle).

Features and Benefits

Aumente a precisão durante reações de transcrição reversa.

• Beneficie-se de uma mistura enzimática otimizada com fidelidade 7 vezes maior que outras transcriptases reversas usadas comumente.
• Valha-se de dados verdadeiramente fiéis, conforme determinado pelo sequenciamento de vários milhões de bases com o Sistema Genome Sequencer 20:

Combine precisão com alta sensibilidade, rendimento alto e transcritos de comprimento total.

• Produza transcritos de comprimento total de até 14 kb com os primers oligonucleotídeos ancorados (dT)₁₈ incluídos no kit.
• Obtenha rendimento excelente.
• Detecte moldes com baixos número de cópias. Faça a transcrição reversa com quantidades tão pequenas quanto 10 pg de molde de RNA.
• Transcreva diversos moldes, mesmo os mais difíceis (p. ex., RNAs ricos em GC com estrutura secundária alta), em temperaturas de até +55 °C.

Obtenha resultados mais rapidamente.

• Reduza o tempo de reação da transcrição reversa para tão pouco quanto 10 minutos.
• Seja o primeiro a terminar.

Analysis Note

Cada lote do kit é testado quanto à função em um ensaio para quantificar a atividade de revisão e em um ensaio de qRT-PCR em duas etapas para quantificar a presença de mRNA de PBGD em RNA total de células K-562.

Other Notes

Visão geral das transcriptases reversas

Figura 1: Precisão da transcriptase reversa de alta fidelidade Transcriptor e de uma transcriptase reversa M-MuLV comumente usada.
A taxa de erro foi determinada por sequenciamento, usando o Sistema Genome Sequencer 20. Foi feita a transcrição reversa do RNA com a transcriptase reversa de alta fidelidade Transcriptor e uma transcriptase reversa M-MuLV comumente usada. Após a purificação do cDNA e a amplificação com uma polimerase de revisão, a taxa de erro das transcriptases reversas foi calculada subtraindo-se a taxa de erro do controle do PCR, realizado com DNA de plasmídeo contendo a mesma sequência. A taxa de erro da transcriptase reversa de alta fidelidade Transcriptor representa a média de quatro experimentos independentes nos quais pelo menos 3,1 x 10⁶ bases foram sequenciadas. Para a transcriptase reversa M-MuLV foram sequenciadas 4,5 x 10⁶ bases.
A precisão é representada como a taxa de erro -1, ou seja, o número médio de bases cuja transcrição reversa é feita com sucesso antes de haver um único erro de transcrição. A transcriptase reversa de alta fidelidade Transcriptor demonstra maior precisão que uma transcriptase reversa M-MuLV padrão, o que resulta em menor taxa de erro durante a síntese de cDNA.

Figura 2: Comparação da transcrição reversa de RNA total para tamanhos de fragmento distintos entre transcriptases reversas diferentes.
Foi feita a transcrição reversa de RNA total (1 μg de RNA total de músculo humano para o fragmento de 2,3 kb; 1 μg de RNA total de HeLa para os fragmentos de 5,4 kb e 9,4 kb; 2 μg de RNA total de cérebro de rato para o fragmento de 12,4 kb) com diferentes transcriptases reversas, segundo as recomendações dos fabricantes. Uma alíquota de 5 μl de cada reação de cDNA foi subsequentemente amplificada com o Expand Long Range dNTPack da Roche. Os resultados mostram que o kit de síntese de cDNA de alta fidelidade Transcriptor transcreve uma ampla gama de tamanhos de fragmentos, com maior rendimento e especificidade que as transcriptases reversas de outros fornecedores.

Figura 3: Comparação de tempos de incubação diferentes para reações de cDNA, usando o kit de síntese de cDNA de alta fidelidade Transcriptor.
Foi feita a transcrição reversa de um micrograma de RNA total de HeLa a +50 °C para os tempos indicados. Alíquotas de cinco microlitros de reações de cDNA foram amplificadas com primers para obter um fragmento de 8,5 kb, usando o Expand Long Range dNTPack da Roche. Todas as reações foram realizadas em duplicata. Os resultados mostram que o kit de síntese de cDNA de alta fidelidade Transcriptor transcreve RNA de modo eficiente com alta velocidade e precisão.

Figura 4: Comparação de tempos de incubação diferentes para reações de cDNA, usando o kit de síntese de cDNA de alta fidelidade Transcriptor.
Foi feita a transcrição reversa de 1 μg de RNA total de HeLa a +50 °C para os tempos indicados. Alíquotas de 5 μl de reações de cDNA foram amplificadas com primers para obter um fragmento de 8,5 kb, usando o Expand Long Range dNTPack da Roche. Todas as reações foram realizadas em duplicata

O kit de síntese de cDNA de alta fidelidade Transcriptor inclui o seguinte:

• Transcriptase reversa de alta fidelidade Transcriptor (mistura de uma transcriptase reversa recombinante e uma enzima mediadora da revisão)
• O tampão de reação de alta fidelidade Transcriptor, concentrado 5x
• O inibidor de RNase Protector
• Mistura de dNTP, grau de PCR
• Primer de oligonucleotídeo (dT)₁₈ ancorado
• Primer hexâmero aleatório
• DTT
• Água, grau de PCR
• RNA controle - fração de RNA total purificada da linhagem celular imortalizada K-562*
• Mistura de primers PBGD controle (primer nas direções 5′ e 3′)*

* Incluído apenas no tamanho de embalagem de 50 reações.

Somente para fins de pesquisas biológicas. Não é destinado ao uso em procedimentos diagnósticos.

Legal Information

LightCycler is a registered trademark of Roche

Informações de segurança

• pictograms: GHS07
• signalword: Warning
• hcodes: H319
• pcodes: P264 - P280 - P305 + P351 + P338 - P337 + P313
• Hazard Classifications: Eye Irrit. 2
• Classe de armazenamento: 12 - Non Combustible Liquids
• wgk: WGK 1
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