Crescimento e manutenção celular
A cultura celular é uma técnica fundamental utilizada em pesquisas em ciências biológicas para estabelecer modelos biológicos relevantes ou para produzir proteínas recombinantes, partículas virais ou terapias biológicas. O crescimento e manutenção de células cultivadas, como células de bactérias, leveduras e mamíferos são realizados em uma cabine de biossegurança (frequentemente chamada de câmara de cultura de tecidos ou células) usando técnica estéril adequada para impedir contaminação microbiana e química.
Tipos de culturas celulares
Duas das abordagens mais proeminentes à cultura celular de mamíferos são a cultura primária e a cultura contínua. Culturas primárias são originárias diretamente de tecido humano ou animal e têm uma vida útil em cultura que é limitada pela senescência celular. Culturas contínuas são consideradas “imortais” em cultura, pois frequentemente derivam de tecido neoplásico de pacientes. Linhagens celulares também podem ser criadas imortalizando as células e podem ser propagadas em série ou repicadas por diversos ciclos de divisão celular, ou indefinidamente.
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Células podem ser cultivadas em suspensão ou como uma monocamada bidimensional que se fixa ao frasco de cultura de tecido ou placa multipoços. O método de cultura é determinado pelo tecido de origem das células, por exemplo, células derivadas de sangue geralmente são cultivadas em suspensão, enquanto as derivadas de tecidos sólidos costumam ser cultivadas em monocamadas.
Em geral, considera-se que modelos de cultura celular tridimensionais (organoides e esferoides) mimetizam melhor o ambiente das células in vivo que as culturas de células em superfícies bidimensionais. Esferoides são frequentemente formados a partir de linhagens celulares neoplásicas ou biópsias tumorais (xenoenxertos derivados de pacientes, ou do inglês PDX) como agregados celulares flutuantes livres em placas de fixação ultrabaixa, ao passo que organoides comumente derivam de células-tronco de tecidos embebidas e que, em seguida, se diferenciam em uma matriz de hidrogel de MEC.
Fases do crescimento celular
Garantir o crescimento celular adequado é fundamental para coletar dados precisos de estudos de cultura celular. As contagens de células podem ser determinadas usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado, que proporciona contagens celulares mais precisas.
O crescimento celular em cultura, em geral, acontece em quatro fases:
- Fase de latência – As células estão se adaptando às condições da cultura e não se dividem.
- Fase de crescimento logarítmico – As células se dividem ativamente, portanto este é o melhor estágio para avaliar o crescimento populacional ou coletar dados. A fase logarítmica tardia é o melhor momento para repicar (subcultivar) células.
- Fase de platô (estacionária) – O crescimento desacelera conforme as células se aproximam de 100% de confluência e as células estão mais suscetíveis a estresse ou dano à medida que os resíduos celulares se acumulam e os recursos se esgotam.
- Fase de declínio – A população de células vivas diminui à medida que a morte celular predomina.
Meios, suplementos e reagentes para cultura celular
As células cultivadas precisam de nutrientes para crescer. Meios de cultura celular de mamíferos devem manter o pH fisiológico, além de fornecer sais, carboidratos, aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos e lipídios, proteínas e peptídeos, elementos-traço e fatores de crescimento balanceados. O soro bovino fetal (FBS) é o suplemento de crescimento mais amplamente usado para cultura celular de mamíferos, pois contém muitos desses nutrientes celulares essenciais e demonstrou auxiliar o crescimento de células e tecidos em cultura. Para aplicações que requerem meios definidos ou componentes animais reduzidos, as formulações de meios isentas de materiais estranhos fornecem formulações sem substâncias de origem animal e de composição conhecida.
Como os meios e suplementos frequentemente fornecem nutrientes ricos para o crescimento de microrganismos oportunistas, uma cultura celular bem-sucedida requer técnica asséptica e observação periódica para garantir a ausência de contaminantes que podem causar morte celular ou confundir o crescimento semelhante ao observado in vivo. Para contaminantes microbianos comuns que não podem ser observados microscopicamente, a análise de rotina com reagentes para detecção de micoplasma protege culturas e ambientes de propagação de tecidos.
Culturas de leveduras, como S. cerevisiae e P. pastoris (Pichia), são comumente usadas em pesquisa para expressão de proteínas recombinantes e estudos de função gênica. Os nutrientes essenciais geralmente incluídos em uma formulação de meio de cultura de levedura são peptona, extrato de levedura e dextrose ou glicose.
Dicas e truques para repicagem de células
A repicagem de células é uma etapa fundamental na cultura celular geral para manter a saúde celular e o crescimento celular ideal. Este tutorial explica o processo de repicagem de células, incluindo a importância da confluência e da densidade celular. O protocolo para repicagem de células envolve processos como monitoramento e contagem de células, tripsinização ou dissociação de células e reinoculação das células em um novo recipiente de cultura.
Ambientes de cultura celular e equipamentos para cultura
Células em cultura são cultivadas e manuseadas com o uso de artigos de plástico estéreis e de uso único, incluindo frascos de cultura de tecido e placas multipoços, pipetas sorológicas, filtros estéreis acopláveis à boca de frascos e filtros de seringa estéreis. Frascos e placas de plástico para cultura de tecidos, em geral, recebem tratamento para ter uma superfície hidrofílica e facilitar a fixação de células aderentes. Como uma alternativa às superfícies bidimensionais, placas à base de membranas microporosas proporcionam um ambiente de crescimento mais fisiológico para ensaios celulares complexos, como migração celular, comunicação entre células e polarização celular.
As células cultivadas devem ser mantidas à temperatura e no ambiente gasoso que recriam esses parâmetros no organismo do qual são originárias. Materiais para cultura contendo células e meios são tipicamente mantidos em aparelhos de incubação que fornecem controle preciso de temperatura e misturas gasosas. No entanto, sistemas de incubação de bancada em pequena escala que empregam microfluídica e facilitam o imageamento de células em cultura ininterrupta podem proporcionar os ambientes mais autênticos para modelos preditivos in vitro.
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