HPLC de moléculas pequenas

A obtenção dos melhores resultados possíveis na análise de moléculas pequenas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), UHPLC ou LC-MS depende da escolha das condições mais adequadas de fase estacionária e fase móvel. A composição química do analito é essencial para escolher a composição química da coluna mais adequada. Outros aspectos, como velocidade, matriz da amostra e número de compostos definem o material de base mais adequado para a fase estacionária.

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HPLC de moléculas pequenas

A análise por HPLC de moléculas pequenas é mais comumente realizada no modo de separação de fase reversa. Para a separação de compostos polares, os métodos de cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) e cromatografia de fase normal também são adequados, sendo que a HILIC é o método preferido. Pode-se usar também modos de separação por troca iônica para a separação de compostos iônicos e cromatografia iônica para ânions ou cátions inorgânicos.

A coluna de HPLC é empacotada com partículas de sílica totalmente porosas, superficialmente porosas, partículas poliméricas, ou consiste em um bastão de sílica monolítica como a fase estacionária. Além disso, são utilizados óxido de alumínio, partículas de zircônia e partículas de carbono. O tamanho de poro típico do material de fase estacionária para separação de moléculas pequenas fica na faixa de 60 Å - 160 Å. Para HPLC, o tamanho da partícula típico da fase estacionária varia de 3 µm a 5 µm, para UHPLC, são usadas partículas menores, geralmente de 2 µm ou menos. Diferentes seletividades (modificações) de coluna podem ser associadas à fase estacionária. Uma cadeia alquílica C18 é a composição química de coluna usada com mais frequência em cromatografia de fase reversa (RP). No entanto, outras modificações, como C30, C8, fenil, pentafluorofenil e diversas outras modificações polares, bem como modificações com propriedades quirais ou de troca iônica possibilitam a separação de quase todos os compostos solúveis em líquidos. A fase móvel para RP-HPLC geralmente consiste em um tampão aquoso ou água e solventes orgânicos miscíveis em água, como acetonitrila ou metanol.

Preparo de amostras para HPLC

Amostras ricas em matriz e complexas, como alimentos, bebidas, cosméticos, amostras biológicas e formulações farmacêuticas ricas em matriz (p. ex., creme, xarope), requerem protocolos de preparo de amostra eficientes para remover componentes indesejados e extrair seletivamente o analito de interesse. Isso é essencial quando se usa uma fase estacionária com partículas de tamanho muito pequeno, como na UHPLC, em que são usadas partículas de 2 µm ou menos. Os métodos comuns de preparo de amostras são extração líquido-líquido, extração em fase sólida (SPE) e, para amostras biológicas, também precipitação de proteínas além de filtração. Além da eluição seletiva e pré-concentração do composto-alvo, a principal finalidade do preparo de amostras é proteger a fase estacionária da HPLC de obstruções causadas pela matriz da amostra. As colunas de HPLC à base de sílica monolítica têm alto grau de tolerância à matriz e requerem muito menos preparo da amostra que as colunas de particulado. 

Derivatização

Para algumas moléculas, a derivatização é necessária, seja antes (pré-coluna) ou após (pós-coluna) a separação por HPLC. A derivatização converte moléculas em seus derivados para melhor sensibilidade ou retenção cromatográfica em HPLC. Reagentes químicos, com propriedades físicas e químicas desejáveis, são usados para a derivatização necessária.

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