Imuno-histoquímica
Métodos de detecção por imuno-histoquímica (IHQ) e imunofluorescência (IF)
A imuno-histoquímica (IHQ) é um método bioquímico que usa anticorpos que se ligam a antígenos específicos em um corte de tecido. Da mesma forma, a imunocitoquímica (ICQ) é adequada para identificar antígenos em camadas celulares individuais. A IHQ é comumente usada para visualizar proteínas, carboidratos e lipídios de interesse em tecidos saudáveis e doentes, como aqueles encontrados em tumores cancerígenos. Marcadores moleculares específicos são característicos de eventos celulares, como a proliferação ou morte celular (apoptose). A IHQ também é muito usada em pesquisa básica para entender a distribuição e localização de biomarcadores e proteínas expressas de modo diferencial em diferentes partes do tecido biológico.
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Preparo de tecido para IHQ, recuperação de antígeno e pré-tratamento
Tipicamente, os tecidos são fixados, embutidos em parafina e cortados para análise de IHQ usando um micrótomo. Um passo significativo após o preparo inicial do tecido é a necessidade de recuperação do antígeno. É necessário quebrar as ligações cruzadas da proteína, formadas durante a fixação, e expor os sítios antigênicos não acessíveis. As condições de recuperação e pré-tratamento de antígenos devem ser determinadas empiricamente, pois a acessibilidade do epítopo do antígeno pode variar significativamente dependendo de inúmeros fatores biológicos. Por exemplo, alguns antígenos podem requerer um pré-tratamento mais agressivo para "desmascarar" seus epítopos de ligação ao anticorpo, enquanto o pré-tratamento pode não ser necessário para outros antígenos. Dois métodos comuns de pré-tratamento para recuperação de antígenos incluem o resgate de sítios antigênicos induzido pelo calor (Heat-Induced Epitope Retrieval (HIER)), onde uma fonte de calor é usada juntamente com tampões e enzimas (proteinase K). O segundo método é a recuperação de epítopos induzida por proteólise (Proteolytic-Induced Epitope Retrieval (PIER)) é outro método de recuperação de antígenos onde várias proteases podem ser usadas, como a proteinase k, tripsina, quimiotripsina ou pepsina.
Coloração e detecção por IHQ
Após o preparo do tecido e o pré-tratamento para recuperação antigênica, a visualização da interação anticorpo-antígeno pode ser feita de várias maneiras. Um método comum usa um anticorpo primário que é conjugado a uma enzima, como a peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina, que catalisa uma reação que produz cor. Alternativamente, o método de imunofluorescência (IF) usa um anticorpo que é marcado com um fluoróforo, como fluoresceína, rodamina ou Alexa Fluor. Outra opção é usar um anticorpo primário não marcado, com detecção indireta de antígeno por um anticorpo secundário marcado ou sistemas de detecção mais complexos. Nesse caso, o título ideal dos anticorpos primário e secundário deve ser determinado para cada ensaio.
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