Quantificação de proteínas
Quantificação de proteínas e ensaios proteicos são fundamentais para determinar com precisão a concentração de proteínas em uma amostra. Existe diversos métodos de quantificação de proteínas, incluindo ensaios de absorbância de UV, ensaios à base de reagentes e tecnologias de imunoensaio. Cada uma dessas tecnologias de quantificação de proteínas tem benefícios únicos e a adequação do ensaio depende do tipo de amostra e/ou volume disponível para análise. Por exemplo, alguns dos ensaios à base de corantes podem interferir com compostos químicos encontrados em preparados de tampão e um ensaio alternativo pode ser mais apropriado. Os cientistas precisam considerar as limitações de cada ensaio para determinar qual é a melhor opção para sua amostra.
Ensaios de absorbância de UV
O uso da absorbância de ultravioleta (UV) para medir a concentração de proteínas é um ensaio de quantificação de proteínas relativamente simples. Aminoácidos com cadeias laterais aromáticas (triptofano, tirosina etc.) conferem às proteínas sua absorbância de UV distinta em 280 nm. Como esses aminoácidos absorvem luz UV em 280 nm, a absorção neste comprimento de onda específico pode ser obtida através de um espectrofotômetro e usada para estimar concentrações proteicas em amostras. Este ensaio relativamente rápido é frequentemente usado em laboratórios, e o método Warburg-Christian é tipicamente realizado para estimar a concentração de proteínas. No entanto, o uso de absorbância de UV para determinar a concentração de proteínas pode apresentar alta variabilidade, porque os componentes não proteicos em uma amostra podem interferir com as medidas de absorbância. Além disso, misturas com diferentes proteínas em uma amostra podem causar variações nas leituras de absorbância devido à diferença nas composições de aminoácidos.
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Ensaios à base de reagentes
Os ensaios à base de reagentes superam os problemas de compatibilidade observados com os métodos de absorbância de UV. Exemplos de ensaios à base de reagentes para quantificação de proteínas incluem aqueles que utilizam métodos colorimétricos, como os ensaios com ácido bicinconínico (BCA), de Lowry e de Bradford. O método de BCA e o método de Lowry envolvem a formação de um complexo de cobre-proteína. Estes são ensaios sensíveis e apresentam menor variabilidade que o ensaio de Bradford. No entanto, o ensaio de Bradford é rápido, fácil de realizar e é compatível com certos agentes redutores, ao contrário dos ensaios de BCA e de Lowry.
Imunoensaios
Alguns ensaios podem não possibilitar a quantificação precisa de proteínas se houver diversas proteínas em uma amostra ou se as quantidades estiverem abaixo do limite de detecção. Poderosas tecnologias de imunoensaio, usando vários métodos de detecção, fornecem um método alternativo para quantificar precisamente proteínas a partir de diversos tipos de amostras. Por exemplo, ensaios multiplex permitem que os pesquisadores quantifiquem várias proteínas em uma amostra simultaneamente. Além disso, a tecnologia de contagem de molécula única pode medir os níveis de fentograma de proteínas para ajudar a identificar e quantificar proteínas presentes em níveis baixos em amostras pequenas. As aplicações de pesquisa que utilizam essas tecnologias incluem medir biomarcadores em tecidos saudáveis ou naqueles associados à progressão de doenças para entender melhor certos estados de doenças.
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