“Pull-down” de proteínas

O ensaio de pull-down é projetado para determinar a interação entre duas ou mais proteínas. Com os ensaios de afinidade por pull-down, uma proteína "isca" é marcada e capturada em um ligante imobilizado (microesferas de suporte) por ligação covalente ou através de uma cauda de afinidade, como cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). As caudas de fusão de proteínas-“isca” comuns incluem glutationa S-transferase (GST) e proteínas com cauda de histidina. A proteína “isca” forma um complexo que é, em seguida, incubado com uma fonte de proteína, como um lisado de células ou tecido. As proteínas de interesse são eluidas das microesferas de suporte através de uma série de lavagens, e são coletadas por centrifugação. O método de afinidade por pull-down de purificação e detecção é diferente dos ensaios de imunoprecipitação (IP) e Co-IP, pois não se baseia em uma interação de anticorpo com antígeno. Com todos os ensaios de pull-down, a amostra purificada é frequentemente analisada por SDS-PAGE, análise espectral em massa e detecção por western blot para outras análises a jusante.

• Aplicações de afinidade por pull-down com GST
• Coimunoprecipitação

Aplicações de afinidade por pull-down com GST

A glutationa S-transferase (GST) é uma proteína de 211 aminoácidos que é encontrada na maioria dos organismos. A GST é frequentemente integrada nos vetores de expressão para produzir a cauda de fusão dentro dos sistemas de expressão de proteínas de E. coli. A cauda de GST é uma cauda proteica grande de aproximadamente 26 kDa, e pode ser expressa em células de bactérias, leveduras, mamíferos e insetos. A cauda de GST é vantajosa quando é necessário proteger a proteína recombinante da clivagem da protease intracelular, e quando há a necessidade de aumentar a solubilidade da proteína marcada. Além disso, a proteína GST fornece uma cauda de alta afinidade para fácil purificação e para experimentos de pull-down utilizando resinas de afinidade baratas que são realizadas em condições brandas de diluição.

Coimunoprecipitação

O ensaio de pull-down é ideal para verificar os resultados da coimunoprecipitação e um excelente método de identificação de interações proteicas desconhecidas, bem como do status de ativação de proteínas específicas. Diferentemente dos métodos de afinidade por pull-down, a IP utiliza anticorpos para se ligar e isolar antígenos de amostras biológicas complexas.

A Co-IP refere-se ao uso de um anticorpo para ligar um antígeno dentro de um complexo multiproteico. O complexo é, em seguida, capturado com a adição de meio de proteína A ou proteína G. A alta afinidade das proteínas A/G com a região Fc de anticorpos do tipo IgG policlonais e monoclonais faz delas um componente crítico na purificação da proteína ou do complexo proteico de interesse. O uso de métodos de pull-down de proteínas é uma ferramenta essencial para investigar as redes de interações proteicas; no entanto, a escolha do método específico será determinada pela necessidade específica da aplicação do pesquisador.