Clonagem e expressão

Vetores de expressão de proteínas

Plasmídeos, ou vetores de expressão de proteínas, são pedaços circulares de DNA que contêm vários elementos funcionais para clonagem e expressão da proteína de interesse. A escolha do vetor de expressão adequado é parcialmente determinada pelo tipo de proteína, pelo organismo que expressará a proteína e pela aplicação específica e questões científicas que o pesquisador pretende abordar. A grande variedade de vetores de expressão disponíveis permite que os pesquisadores escolham quais elementos de clonagem, seleção de clones e expressão de proteínas são melhores para seu estudo. Uma vez selecionada a sequência gênica de interesse e o vetor de expressão, os pesquisadores geralmente usam nucleases para cortar precisamente o vetor em sítios específicos para permitir que a sequência genética de interesse seja clonada dentro do quadro de leitura e, por fim, expressa em um organismo hospedeiro. É importante ressaltar que os pesquisadores geralmente usam células quimicamente competentes e transformação bacteriana para hospedar os plasmídeos de DNA recombinantes, pois eles são estáveis quando armazenados congelados a -70 °C.

Como transfectar células

A transfecção celular é o processo de introdução de DNA, RNA ou de proteínas em células eucarióticas. Diversas tecnologias físicas, químicas e biológicas estão disponíveis para os pesquisadores realizarem essa parte do fluxo de trabalho de expressão de proteínas. Métodos físicos, como a eletroporação, ou métodos químicos, inclusive fosfato de cálcio (CaPi), polietilenimina (PEI) e reagentes de lipofecção, são todos comumente usados pelos pesquisadores. Sistemas de transdução viral, incluindo lentivírus, oncorretrovírus e adenovírus, também estão disponíveis para os cientistas. No entanto, o uso de métodos de liberação viral muitas vezes requer contenção e monitoramento adicionais, por razões de biossegurança.

Sistemas de expressão de proteínas

Vários organismos são usados por pesquisadores para expressar sua proteína de interesse. As bactérias são comumente usadas pelos pesquisadores, pois captam eficientemente vetores de expressão, têm tempos de duplicação rápidos e podem produzir grandes quantidades de proteína em condições ideais. No entanto, como as bactérias são organismos procarióticos, elas não são capazes de fornecer as modificações proteicas pós-tradução que algumas proteínas requerem. As células eucarióticas, incluindo leveduras e linhagens celulares de mamíferos, facilitam modificação(ões) pós-tradução de proteínas e também são comumente usadas pelos pesquisadores. A escolha da melhor linhagem celular para a expressão de uma proteína recombinante e a estratégia de expressão de proteica são altamente dependente das necessidades específicas de aplicação e perguntas que o cientista pretende abordar.