17-10203

LentiBrite RFP-β-aktyna Biosensor lentiwirusowy

• UNSPSC Code: 12352207
• NACRES: NA.51
• eCl@ss: 34360190
• Technique(s): cell based assay: suitable, immunocytochemistry: suitable, immunofluorescence: suitable, single cell analysis: suitable, transfection: suitable

Właściwości

• Quality Segment: 100
• manufacturer/tradename: Chemicon^®, LentiBrite
• technique(s): cell based assay: suitable, immunocytochemistry: suitable, immunofluorescence: suitable, single cell analysis: suitable, transfection: suitable
• UniProt accession no.: P60709
• detection method: fluorometric
• shipped in: dry ice
• storage temp.: -65 to -96°C

Opis

General description

Przeczytaj naszą notę aplikacyjną w Nature Methods!
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
(Kliknij tutaj!</A>)

Dowiedz się więcej o zaletach naszych LentiBrite Lentiviral Biosensors! Kliknij tutaj

Biosensory mogą być używane do wykrywania obecności/braku określonego białka, jak również subkomórkowej lokalizacji tego białka w żywej komórce. Znaczniki fluorescencyjne są często pożądane jako środek do wizualizacji interesującego białka w komórce za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub poklatkowego przechwytywania wideo. Wizualizacja żywych komórek bez zakłóceń pozwala badaczom obserwować warunki komórkowe w czasie rzeczywistym.

Systemy wektorów lentiwirusowych są popularnym narzędziem badawczym wykorzystywanym do wprowadzania produktów genowych do komórek. Transfekcja lentiwirusowa ma przewagę nad metodami niewirusowymi, takimi jak transfekcja chemiczna, w tym wyższą wydajność transfekcji komórek dzielących się i nie dzielących się, długotrwałą stabilną ekspresję transgenu i niską immunogenność.

EMD Millipore wprowadza LentiBrite Lentiviral Biosensors, nowy zestaw wstępnie zapakowanych cząstek lentiwirusowych kodujących ważne i podstawowe białka autofagii, apoptozy i struktury komórkowej do wizualizacji w różnych stanach komórkowych/chorobowych w analizie żywych komórek i in vitro.

• Wstępnie zapakowane, znakowane fluorescencyjnie za pomocą GFP i RFP
• Wyższa skuteczność transfekcji w porównaniu z tradycyjnymi metodami chemicznymi i innymi metodami transfekcji niewirusowej
• Zdolność do transfekcji dzielących się, nie dzielących się i trudnych do transfekcji typów komórek, takich jak komórki pierwotne lub macierzyste
• Brak zakłóceń funkcji komórkowych

Cząsteczki LentiBrite RFP-β-aktyny firmy EMD Millipore zapewniają jasną fluorescencję i precyzyjną lokalizację, umożliwiając analizę dynamiki mikrofilamentów aktyny w komórkach trudnych do transfekcji.

Aktyna jest bardzo obfitym białkiem kulistym występującym w cytozolu wszystkich komórek eukariotycznych, które gromadzi się w układzie głowa-ogon, tworząc podwójne spiralne, spolaryzowane mikrofilamenty. Mikrofilamenty aktyny stanowią jedną z 3 głównych struktur cytoszkieletu i uczestniczą w wielu ważnych procesach komórkowych, w tym w skurczu mięśni, ruchliwości komórek, cytokinezie, ruchu pęcherzyków i organelli, sygnalizacji komórkowej, tworzeniu i utrzymywaniu połączeń komórkowych oraz kształcie komórek. U kręgowców zidentyfikowano trzy główne grupy izoform aktyny, alfa, beta i gamma; w większości typów komórek β-aktyna jest głównym składnikiem cytoszkieletu. Fuzje białek fluorescencyjnych z β-aktyną okazały się bardzo użytecznymi narzędziami w wyjaśnianiu dynamiki mikrofilamentów aktyny w wielu procesach komórkowych.
Cząsteczki lentiwirusowe LentiBrite RFP-β-aktyny firmy EMD Millipore zapewniają jasną fluorescencję i precyzyjną lokalizację, umożliwiając analizę dynamiki mikrofilamentów aktyny w komórkach trudnych do transfekcji.

Application

Porównanie immunocytochemiczne i analiza inhibitorów:
Podobnie jak na rysunku 1 w arkuszu danych, komórki HeLa umieszczono na szkiełku komorowym i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 20 przez 24 godziny. Po wymianie pożywki i dalszej 48-godzinnej inkubacji, komórki były albo nieleczone, albo inkubowane przez 2 godziny w pełnej pożywce zawierającej 2 µM cytochalazyny-D, albo inkubowane przez 2 godziny w pełnej pożywce zawierającej 200nM jasplakinolidu w celu wywołania depolimeryzacji aktyny. Barwienie immunocytochemiczne (kolor zielony) tych samych pól widzenia za pomocą falloidyny sprzężonej z FIITC ujawnia podobne wzorce ekspresji do białka RFP (kolor czerwony).

Trudne do transfekcji typy komórek:
Pierwotne typy komórek HUVEC lub HuMSC umieszczono na szkiełkach komorowych i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi przy MOI 40 przez 24 godziny.

Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej: Komórki HeLa i HT-1080 traktowano jak na rysunkach 2A i 2B w arkuszu danych. Obrazy uzyskano za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej z zanurzeniem w oleju.

Aby uzyskać optymalną wizualizację fluorescencji, zaleca się analizę docelowego poziomu ekspresji w ciągu 24-48 godzin po transfekcji/infekcji w celu optymalnej analizy żywych komórek, ponieważ intensywność fluorescencji może z czasem słabnąć, szczególnie w trudnych do transfekcji liniach komórkowych. Zainfekowane komórki można zamrozić po udanej transfekcji/infekcji i rozmrozić w hodowli, aby zachować dodatnią ekspresję fluorescencyjną przez ponad 24-48 godzin. Długość i intensywność ekspresji fluorescencyjnej różni się w zależności od linii komórkowej. W przypadku trudnych do transfekcji linii komórkowych może być wymagane wyższe MOI.

Analysis Note

Evaluated by transduction of HT-1080 cells and fluorescent imaging performed for assessment of transduction efficiency.

Other Notes

TagRFP-β-actin Lentivirus:
One vial containing 25 µL of lentiviral particles at a minimum of 3 x 10E8 infectious units (IFU) per mL. For lot-specific titer information, please see “Viral Titer” in the product specifications above.


Promoter
EF-1 (Elongation Factor-1)


Multiplicty of Infection (MOI)
MOI = Ratio of # of infectious lentiviral particles (IFU) to # of cells being infected.
Typical MOI values for high transduction efficiency and signal intensity are in the range of 20-40. For this target, some cell types may require lower MOIs (e.g., HT-1080, U2OS), while others may require higher MOIs (e.g., human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human mesenchymal stem cells (HuMSC), HeLa).
NOTE: MOI should be titrated and optimized by the end user for each cell type and lentiviral target to achieve desired transduction efficiency and signal intensity.

Legal Information

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Ta strona może zawierać tekst przetłumaczony maszynowo.

Informacja o środkach bezpieczeństwa

• Klasa składowania: 10 - Combustible liquids
• wgk: WGK 2