Techniki ściągania białek

Test pull-down został zaprojektowany w celu określenia interakcji dwóch lub więcej białek. W testach ściągania powinowactwa białko "przynęty" jest znakowane i wychwytywane na unieruchomionym ligandzie (kulkach nośnych) poprzez kowalencyjne przyłączenie lub poprzez znacznik powinowactwa, taki jak unieruchomiona chromatografia powinowactwa do metalu (IMAC). Typowe znaczniki fuzyjne białek przynęty obejmują S-transferazę glutationową (GST) i białka znakowane histydyną. Białko przynęty tworzy kompleks, który jest następnie inkubowany ze źródłem białka, takim jak lizat komórek lub tkanek. Białka będące przedmiotem zainteresowania są wymywane z koralikowego nośnika przez serię płukań i zbierane przez odwirowanie. Metoda powinowactwa pull-down oczyszczania i wykrywania różni się od testów immunoprecypitacji (IP) i Co-IP tym, że nie jest to interakcja przeciwciała z antygenem. W przypadku wszystkich testów pull-down, oczyszczona próbka jest często analizowana za pomocą SDS-PAGE, analizy spektralnej masy i wykrywania western blot w celu dalszej analizy.

• Affinity GST Pull-down Applications
• Co-immunoprecypitacja

Affinity GST Pull-Down Applications

S-transferaza glutationowa (GST) to 211-aminokwasowe białko występujące w większości organizmów. GST jest często integrowana z wektorami ekspresyjnymi w celu wytworzenia znacznika fuzyjnego w systemach ekspresji białek E. coli. Znacznik GST jest dużym znacznikiem białkowym, około 26 kDa, i może być wyrażany w komórkach bakterii, drożdży, ssaków i owadów. Znacznik GST jest korzystny, gdy wymagana jest ochrona rekombinowanego białka przed wewnątrzkomórkowym rozszczepieniem proteazy oraz gdy istnieje potrzeba zwiększenia rozpuszczalności znakowanego białka. Ponadto, białko GST zapewnia znacznik o wysokim powinowactwie do łatwego oczyszczania i eksperymentów pull-down wykorzystujących niedrogie żywice powinowactwa, które są przeprowadzane w łagodnych warunkach elucji.

Co-immunoprecypitacja

Test pull-down jest idealny do weryfikacji wyników co-immunoprecypitacji i stanowi doskonałą metodę identyfikacji nieznanych interakcji białko-białko wraz ze statusem aktywacji określonych białek. W przeciwieństwie do metod ściągania powinowactwa, IP wykorzystuje przeciwciała do wiązania i izolowania antygenów ze złożonych próbek biologicznych. 

Co-IP odnosi się do stosowania przeciwciała do wiązania antygenu w kompleksie wielobiałkowym. Kompleks jest następnie wychwytywany z dodatkiem białka A lub białka G. Wysokie powinowactwo białka A/G do regionu Fc przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych typu IgG sprawia, że są one krytycznym składnikiem w oczyszczaniu białka lub kompleksu białkowego będącego przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie metod ściągania białek jest niezbędnym narzędziem do badania sieci interakcji białko-białko; jednak wybór konkretnej metody będzie zależał od konkretnych potrzeb naukowca.