Immunohistochemia

Przygotowanie tkanek IHC, odzyskiwanie antygenu i obróbka wstępna

Tkanki są zazwyczaj utrwalane, zatapiane w parafinie i skrawane do analizy IHC przy użyciu mikrotomu. Istotnym krokiem następującym po wstępnym przygotowaniu tkanki jest potrzeba odzyskania antygenu. Jest to konieczne, aby przerwać wiązania krzyżowe białek powstałe podczas utrwalania i odkryć ukryte miejsca antygenowe.  Warunki odzyskiwania antygenu i obróbki wstępnej muszą być określone empirycznie, ponieważ dostępność epitopu antygenu może się znacznie różnić w zależności od wielu czynników biologicznych.  Na przykład, niektóre antygeny mogą wymagać bardziej agresywnej obróbki wstępnej w celu "zdemaskowania" ich epitopów wiążących przeciwciała, podczas gdy obróbka wstępna może nie być w ogóle wymagana dla niektórych antygenów. Dwie powszechne metody wstępnego odzyskiwania antygenu obejmują odzyskiwanie epitopu indukowane ciepłem (HIER), w którym źródło ciepła jest używane w połączeniu z buforami i enzymami (proteinaza K). Druga metoda, Proteolytic-Induced Epitope Retrieval (PIER) to kolejna metoda odzyskiwania antygenu, w której można stosować różne proteazy, takie jak proteinaza K, trypsyna, chymotrypsyna lub pepsyna.

Barwienie i detekcja IHC

Po przygotowaniu tkanki i wstępnej obróbce antygenu, wizualizację interakcji przeciwciało-antygen można osiągnąć na wiele sposobów. Jedna z powszechnych metod wykorzystuje pierwotne przeciwciało, które jest sprzężone z enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna, który katalizuje reakcję wytwarzającą kolor. Alternatywnie, metoda immunofluorescencji (IF) wykorzystuje przeciwciało, które jest znakowane fluoroforem, takim jak fluoresceina, rodamina lub Alexa Fluor. Inną opcją jest użycie nieznakowanego przeciwciała pierwotnego, z pośrednim wykrywaniem antygenu przez znakowane przeciwciało wtórne lub bardziej złożone systemy wykrywania. W takim przypadku należy określić optymalne miano zarówno przeciwciała pierwotnego, jak i wtórnego dla każdego testu.