17-10189

Biosensor LentiBrite GFP-LC3 z kontrolnym mutantem lentiwirusowym

• Synonim(y): Białko związane z mikrotubulami 1A/1B łańcuch lekki 3, białko związane z autofagią LC3, związany z autofagią modyfikator ubikwityny LC3, MAP1A/MAP1B łańcuch lekki 3, białko związane z mikrotubulami 1 łańcuch lekki 3
• UNSPSC Code: 12352207
• NACRES: NA.51
• eCl@ss: 34360190
• Technique(s): cell based assay: suitable, immunocytochemistry: suitable, immunofluorescence: suitable, transfection: suitable

Właściwości

• Quality Segment: 100
• manufacturer/tradename: Chemicon^®, LentiBrite
• technique(s): cell based assay: suitable, immunocytochemistry: suitable, immunofluorescence: suitable, transfection: suitable
• UniProt accession no.: Q9GZQ8, Q9H492
• detection method: fluorometric
• shipped in: dry ice
• storage temp.: -65 to -96°C

Opis

General description

Przeczytaj naszą notę aplikacyjną w Nature Methods!
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
(Kliknij tutaj!</A>)

Dowiedz się więcej o zaletach naszych LentiBrite Lentiviral Biosensors! Kliknijtutaj

Biosensory mogą być używane do wykrywania obecności/braku określonego białka, jak również subkomórkowej lokalizacji tego białka w żywej komórce. Znaczniki fluorescencyjne są często pożądane jako środek do wizualizacji interesującego białka w komórce za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub poklatkowego przechwytywania wideo. Wizualizacja żywych komórek bez zakłóceń pozwala badaczom obserwować warunki komórkowe w czasie rzeczywistym.

Systemy wektorów lentiwirusowych są popularnym narzędziem badawczym wykorzystywanym do wprowadzania produktów genowych do komórek. Transfekcja lentiwirusowa ma przewagę nad metodami niewirusowymi, takimi jak transfekcja chemiczna, w tym wyższą wydajność transfekcji komórek dzielących się i nie dzielących się, długotrwałą stabilną ekspresję transgenu i niską immunogenność.

EMD Millipore wprowadza LentiBrite Lentiviral Biosensors, nowy zestaw wstępnie zapakowanych cząstek lentiwirusowych kodujących ważne i podstawowe białka autofagii, apoptozy i struktury komórkowej do wizualizacji w różnych stanach komórkowych/chorobowych w analizie żywych komórek i in vitro.

• Wstępnie zapakowane, znakowane fluorescencyjnie za pomocą GFP i RFP
• Wyższa skuteczność transfekcji w porównaniu z tradycyjnymi metodami chemicznymi i innymi metodami transfekcji niewirusowej
• Zdolność do transfekcji dzielących się, nie dzielących się i trudnych do transfekcji typów komórek, takich jak komórki pierwotne lub macierzyste
• Brak zakłóceń funkcji komórkowych

Cząsteczki lentiwirusowe LentiBrite GFP-LC3-G120A firmy EMD Millipore służą jako kontrola negatywna obok GFP-LC3 typu dzikiego (nr katalogowy 17-10193) do analizy autofagii w żywych komórkach.

Autofagia, szlak degradacji, który zapewnia komórkom recykling składników odżywczych pod wpływem stresu, odgrywa zarówno ochronną, jak i szkodliwą rolę w wielu chorobach, w tym nowotworach, neurodegeneracji i infekcjach. Członkowie rodziny LC3 odgrywają kluczową rolę w dojrzewaniu autofagosomu, centralnej organelli autofagii. Prekursory LC3, rozproszone w cytozolu, są proteolitycznie przetwarzane do postaci LC3-I. Po zainicjowaniu autofagii, C-końcowa glicyna jest modyfikowana przez dodanie fosfatydyloetanoloaminy (PE), tworząc LC3-II, który szybko przemieszcza się do powstających autofagosomów w punktowym rozmieszczeniu. Konstrukty DNA kodujące białka fluorescencyjne połączone z LC3 są szeroko stosowane do wprowadzania do komórek w celu monitorowania tworzenia autofagosomów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Zmutowana forma LC3 z C-końcową glicyną zmienioną na alaninę (LC3-G120A) nie jest w stanie zaakceptować modyfikacji PE i nie przemieszcza się do autofagosomu po indukcji autofagii.
Cząsteczki LentiBrite GFP-LC3-G120A firmy EMD Millipore służą jako kontrola negatywna obok GFP-LC3 typu dzikiego (nr katalogowy 17-10193) do analizy autofagii w żywych komórkach.

Application

Mikroskopia fluorescencyjna
Obrazowanie:
(Patrz rysunek 1 w arkuszu danych)
Komórki HT-1080 umieszczono na szkiełku komorowym i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 20 przez 24 godziny. Po wymianie pożywki i dalszej 48-godzinnej inkubacji, komórki pozostawiono w pełnej pożywce lub inkubowano przez 4 godziny w EBSS zawierającym inhibitor lizosomów, aby wywołać autofagię i zahamować lizosomalną degradację autofagosomów. Komórki utrwalono formaldehydem i zamontowano. Obrazy uzyskano za pomocą zanurzeniowej mikroskopii fluorescencyjnej szerokiego pola. Mutant kontrolny GFP-LC3 wykazuje rozproszoną dystrybucję jądrową i cytozolową zarówno w komórkach autofagicznych karmionych, jak i głodzonych (tj. brak translokacji do punktowej dystrybucji cytoplazmatycznej charakterystycznej dla LC3 typu dzikiego).

Porównanie immunocytochemiczne i analiza inhibitorów:
(Patrz rysunek 2 w arkuszu danych)
Podobnie do warunków przedstawionych na rysunku 1 (patrz arkusz danych), komórki HeLa umieszczono na szkiełku komorowym i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 20 przez 24 godziny. Po wymianie pożywki i dalszej 48-godzinnej inkubacji, komórki pozostawiono w pełnej pożywce, inkubowano przez 4 godziny w EBSS zawierającym inhibitor lizosomów w celu indukcji autofagii i zahamowania degradacji lizosomów lub inkubowano jak poprzednio, z dodatkiem 5 mM 3-metyloadeniny (3-MA) jako inhibitora autofagii. 3-MA nie wpływa na lokalizację mutanta kontrolnego GFP-LC3. Barwienie immunocytochemiczne (czerwony) tych samych pól widzenia przeciwciałem monoklonalnym przeciwko LC3A ujawnia podobny wzór ekspresji do zmutowanego białka (zielony) w warunkach żywienia. Immunobarwienie głodzonych komórek wykazuje punktowy rozkład endogennego LC3 typu dzikiego, podczas gdy sygnał po leczeniu 3-MA jest zmniejszony.

Trudne do transfekcji typy komórek:
(Patrz rysunek 3 w arkuszu danych)
Pierwotne typy komórek HUVEC lub HuMSC umieszczono na szkiełkach komorowych i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 40 przez 24 godziny. Późniejsze leczenie komórek pozostawionych w pełnej pożywce lub komórek inkubowanych w EBSS z inhibitorem lizosomów przeprowadzono jak na rysunkach 1A i 1B (patrz arkusz danych).

Aby uzyskać optymalną wizualizację fluorescencji, zaleca się analizę docelowego poziomu ekspresji w ciągu 24-48 godzin po transfekcji/infekcji w celu optymalnej analizy żywych komórek, ponieważ intensywność fluorescencji może z czasem słabnąć, szczególnie w trudnych do transfekcji liniach komórkowych. Zainfekowane komórki można zamrozić po udanej transfekcji/infekcji i rozmrozić w hodowli, aby zachować dodatnią ekspresję fluorescencyjną przez ponad 24-48 godzin. Długość i intensywność ekspresji fluorescencyjnej różni się w zależności od linii komórkowej. W przypadku trudnych do transfekcji linii komórkowych może być wymagane wyższe MOI.

Research Category
Apoptosis & Cancer

Neuroscience

Research Sub Category
Apoptosis - Additional

Neurodegenerative Diseases

Physical form

PEG precipitation

Preparation Note

Przechowywanie i obsługa
Lentiwirus jest stabilny przez co najmniej 4 miesiące od daty otrzymania, gdy jest przechowywany w temperaturze -80°C. Po pierwszym rozmrożeniu natychmiast umieścić na lodzie i zamrozić w podwielokrotnościach roboczych w temperaturze -80°C. Zamrożone podwielokrotności mogą być przechowywane przez co najmniej 2 miesiące. Dalsze zamrażanie/rozmrażanie może spowodować zmniejszenie miana wirusa i wydajności transdukcji.

WAŻNA UWAGA DOTYCZĄCA BEZPIECZEŃSTWA
Wektory lentiwirusowe z defektem replikacji, takie jak wektor 3. generacji dostarczony w tym produkcie, nie powodują żadnych chorób u ludzi ani zwierząt. Jednakże, lentiwirusy mogą integrować się z genomem komórki gospodarza i tym samym stwarzać pewne ryzyko mutagenezy insercyjnej. Materiał należy do grupy ryzyka 2 i powinien być obsługiwany pod kontrolą BSL2. Szczegółowe omówienie bezpieczeństwa biologicznego wektorów lentiwirusowych znajduje się w Pauwels, K. et al. (2009). Najnowocześniejsze wektory lentiwirusowe do zastosowań badawczych: Ocena ryzyka i zalecenia dotyczące bezpieczeństwa biologicznego. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.

Analysis Note

Evaluated by transduction of HT-1080 cells and fluorescent imaging performed for assessment of transduction efficiency.

Other Notes

TagGFP2-LC3-G120A (Mutant) Lentivirus:
One vial containing 25 µL of lentiviral particles at a minimum of 3 x 10E8 infectious units (IFU) per mL.
For lot-specific titer information, please see lot specific “Viral Titer” in the product specifications of the datasheet.


Promoter
EF-1 (Elongation Factor-1)



Multiplicty of Infection (MOI)
MOI = Ratio of # of infectious lentiviral particles (IFU) to # of cells being infected.
Typical MOI values for high transduction efficiency and signal intensity are in the range of 20-40. For this target, some cell types may require lower MOIs (e.g., HeLa, human mesenchymal stem cells (HuMSC)), while others may require higher MOIs (e.g., HT-1080, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), U2OS).
NOTE: MOI should be titrated and optimized by the end user for each cell type and lentiviral target to achieve desired transduction efficiency and signal intensity.

Legal Information

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Ta strona może zawierać tekst przetłumaczony maszynowo.

Informacja o środkach bezpieczeństwa

• Klasa składowania: 10 - Combustible liquids
• wgk: WGK 2