17-10154

Biosensor lentiwirusowy LentiBrite Paxillin-GFP

• UNSPSC Code: 12352207
• NACRES: NA.32
• eCl@ss: 34360190
• Technique(s): cell based assay: suitable, immunocytochemistry: suitable, immunofluorescence: suitable, transfection: suitable

Właściwości

• Quality Segment: 100
• manufacturer/tradename: Chemicon^®, LentiBrite
• technique(s): cell based assay: suitable, immunocytochemistry: suitable, immunofluorescence: suitable, transfection: suitable
• UniProt accession no.: P49023
• detection method: fluorometric
• shipped in: dry ice
• storage temp.: -65 to -96°C

Opis

General description

Przeczytaj naszą notę aplikacyjną w Nature Methods!
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
(Kliknij tutaj!</A>)

Dowiedz się więcej o zaletach naszych LentiBrite Lentiviral Biosensors! Kliknij tutaj

Biosensory mogą być używane do wykrywania obecności/braku określonego białka, jak również subkomórkowej lokalizacji tego białka w żywej komórce. Znaczniki fluorescencyjne są często pożądane jako środek do wizualizacji interesującego białka w komórce za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub poklatkowego przechwytywania wideo. Wizualizacja żywych komórek bez zakłóceń pozwala badaczom obserwować warunki komórkowe w czasie rzeczywistym.

Systemy wektorów lentiwirusowych są popularnym narzędziem badawczym wykorzystywanym do wprowadzania produktów genowych do komórek. Transfekcja lentiwirusowa ma przewagę nad metodami niewirusowymi, takimi jak transfekcja chemiczna, w tym wyższą wydajność transfekcji komórek dzielących się i nie dzielących się, długotrwałą stabilną ekspresję transgenu i niską immunogenność.

EMD Millipore wprowadza LentiBrite Lentiviral Biosensors, nowy zestaw wstępnie zapakowanych cząstek lentiwirusowych kodujących ważne i podstawowe białka autofagii, apoptozy i struktury komórkowej do wizualizacji w różnych stanach komórkowych/chorobowych w analizie żywych komórek i in vitro.

• Wstępnie zapakowane, znakowane fluorescencyjnie za pomocą GFP i RFP
• Wyższa skuteczność transfekcji w porównaniu z tradycyjnymi metodami chemicznymi i innymi metodami transfekcji niewirusowej
• Zdolność do transfekcji dzielących się, nie dzielących się i trudnych do transfekcji typów komórek, takich jak komórki pierwotne lub macierzyste
• Brak zakłóceń funkcji komórkowych

Cząsteczki lentiwirusowe LentiBrite Paxillin-GFP firmy EMD Millipore zapewniają jasną fluorescencję i precyzyjną lokalizację, umożliwiając analizę autofagii w żywych komórkach w trudnych do transfekcji typach komórek.

Komórki adherentne utrzymują kontakt z podłożem zewnątrzkomórkowym za pomocą zrostów ogniskowych, składających się z receptorów macierzy przezbłonowej (integryn) połączonych po stronie cytoplazmatycznej z kompleksem białek sygnalizacyjnych i strukturalnych związanych z cytoszkieletem. Paksylina, jedno z pierwszych białek rekrutowanych do powstających zrostów, służy jako białko rusztowania dla kinaz (Src, FAK), czynników wymiany GTP i innych białek strukturalnych oraz odgrywa kluczową rolę w montażu i demontażu zrostów ogniskowych. Ogniskowe zrosty są wysoce dynamicznymi strukturami, które gromadzą się na przedniej krawędzi migrującej komórki i rozpadają się na krawędzi końcowej. Fuzje między paksyliną i białkami fluorescencyjnymi były szeroko stosowane do analizy dynamiki adhezji ogniskowej w żywych komórkach.
Cząsteczki lentiwirusowe LentiBrite Paxillin-GFP firmy EMD Millipore zapewniają jasną fluorescencję i precyzyjną lokalizację, aby umożliwić analizę dynamiki adhezji ogniskowej w żywych komórkach w trudnych do transfekcji typach komórek.

Application

Obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej:
(Patrz rysunek 1 w arkuszu danych)
Komórki U2OS umieszczono w szkiełku komorowym i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 5 przez 24 godziny. Po wymianie pożywki i 48 godzinach dalszej inkubacji, komórki utrwalono formaldehydem i zamontowano. Obrazy uzyskano za pomocą zanurzeniowej mikroskopii fluorescencyjnej szerokiego pola.
Paxillin-GFP wykazuje punktową dystrybucję w ogniskowych zrostach w komórkach.

Porównanie immunocytochemiczne:
(Patrz rysunek 2 w arkuszu danych)
Podobnie jak na rysunku 1, komórki HeLa umieszczono na szkiełku komorowym i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 40 przez 24 godziny. Po 24 godzinach wymieniono pożywkę, a następnie komórki inkubowano przez 48 godzin. Barwienie immunocytochemiczne (czerwone) tych samych pól widzenia przeciwciałem monoklonalnym przeciwko Paxillin (nr kat. 05-417) ujawnia podobne wzorce ekspresji jak białko-GFP (zielone).

Trudne do transfekcji typy komórek:
(Patrz rysunek 3 w arkuszu danych)
Pierwotne typy komórek HUVEC lub HuMSC umieszczono na szkiełkach komorowych i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi przy MOI odpowiednio 20 i 5 przez 24 godziny.

Dodatkowe typy komórek:
(Patrz rysunek 4 w arkuszu danych)
Komórki HT1080 i REF52 traktowano jak na rysunku 1.

Aby uzyskać optymalną wizualizację fluorescencji, zaleca się analizę docelowego poziomu ekspresji w ciągu 24-48 godzin po transfekcji/infekcji w celu optymalnej analizy żywych komórek, ponieważ intensywność fluorescencji może z czasem słabnąć, szczególnie w trudnych do transfekcji liniach komórkowych. Zainfekowane komórki można zamrozić po udanej transfekcji/infekcji i rozmrozić w hodowli, aby zachować dodatnią ekspresję fluorescencyjną przez ponad 24-48 godzin. Długość i intensywność ekspresji fluorescencyjnej różni się w zależności od linii komórkowej. W przypadku trudnych do transfekcji linii komórkowych może być wymagane wyższe MOI.

Research Category
Cell Structure

Research Sub Category
Adhesion (CAMs)

Physical form

PEG precipitation

Preparation Note

Przechowywanie i obsługa
Lentiwirus jest stabilny przez co najmniej 4 miesiące od daty otrzymania, gdy jest przechowywany w temperaturze -80°C. Po pierwszym rozmrożeniu natychmiast umieścić na lodzie i zamrozić w podwielokrotnościach roboczych w temperaturze -80°C. Zamrożone podwielokrotności mogą być przechowywane przez co najmniej 2 miesiące. Dalsze zamrażanie/rozmrażanie może spowodować zmniejszenie miana wirusa i wydajności transdukcji.

WAŻNA UWAGA DOTYCZĄCA BEZPIECZEŃSTWA
Wektory lentiwirusowe z defektem replikacji, takie jak wektor 3. generacji dostarczony w tym produkcie, nie powodują żadnych chorób u ludzi ani zwierząt. Jednakże, lentiwirusy mogą integrować się z genomem komórki gospodarza i tym samym stwarzać pewne ryzyko mutagenezy insercyjnej. Materiał należy do grupy ryzyka 2 i powinien być obsługiwany pod kontrolą BSL2. Szczegółowe omówienie bezpieczeństwa biologicznego wektorów lentiwirusowych znajduje się w Pauwels, K. et al. (2009). Najnowocześniejsze wektory lentiwirusowe do zastosowań badawczych: Ocena ryzyka i zalecenia dotyczące bezpieczeństwa biologicznego. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.

Analysis Note

Evaluated by transduction of HT-1080 cells at MOI values of 20 and 40. Fluorescent imaging performed for assessment of target localization and transduction efficiency.

Other Notes

Paxillin-TagGFP2 Lentivirus:
One vial containing 25 µL of lentiviral particles at a minimum of 3 x 10E8 infectious units (IFU) per mL.
For lot-specific titer information, please see “Viral Titer” in the product box above.


Promoter
EF-1 (Elongation Factor-1)


Multiplicty of Infection (MOI)
MOI = Ratio of # of infectious lentiviral particles (IFU) to # of cells being infected.
Typical MOI values for high transduction efficiency and signal intensity are in the range of 20-40. For this target, some cell types may require lower MOIs (e.g., HT-1080, HeLa, U2OS, human mesenchymal stem cells (HuMSC)), while others may require higher MOIs (e.g., human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)).
NOTE: MOI should be titrated and optimized by the end user for each cell type and lentiviral target to achieve desired transduction efficiency and signal intensity.

Legal Information

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Ta strona może zawierać tekst przetłumaczony maszynowo.

Informacja o środkach bezpieczeństwa

• Klasa składowania: 10 - Combustible liquids
• wgk: WGK 2