S4530
EX-WAX Extraktionskit für in Paraffin eingebettete DNA
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About This Item
UNSPSC-Code:
12161503
eCl@ss:
32161000
NACRES:
NA.51
Preise und Verfügbarkeit sind derzeit nicht verfügbar.
Empfohlene Produkte
Hersteller/Markenname
Chemicon®
EX-WAX
Qualitätsniveau
Methode(n)
DNA extraction: suitable
Anwendung(en)
sample preparation
Versandbedingung
ambient
Allgemeine Beschreibung
Das CHEMICON EX-WAX DNA-Extraktionskit ist zur DNA-Extraktion aus in 10 % Formalin oder nicht quervernetzten Fixiermitteln fixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe bestimmt. Mit diesem Kit extrahierte DNA eignet sich zur Amplifikation mittels PCR.
Grenzwerte:
Die Qualität der extrahierten DNA steht in direktem Zusammenhang mit der Qualität des eingebetteten Gewebes. Bei unsanfter oder längerer Fixierung werden die Ergebnisse negativ beeinflusst.
Zusammenfassung und Prinzip
Das EX-WAX DNA-Extraktionskit eignet sich für in 10 % Formalin oder nicht quervernetzten Fixiermitteln fixiertes und in Paraffin eingebettetes Säugetiergewebe. Die DNA wird durch den Proteinverdau zugänglich. Die DNA wird solubilisiert und die verdauten Proteine werden „entsalzt“ und an den Röhrchenboden zentrifugiert. Die DNA wird ausgefällt, unter Vakuum getrocknet und erneut suspendiert. In Lösung ist die DNA schließlich für die Amplifikation mittels PCR geeignet.
Warnungen und Vorsichtshinweise
1. Beim Isolieren und Handhaben von DNA sind Handschuhe zu tragen, um die Aktivität der endogenen Nukleasen zu minimieren. Für zusätzlichen Schutz vor den Nukleasen autoklavierte Pipettenspitzen und 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen verwenden.
2. Die Volumina sind für fünf 5 μm dicke Gewebeschnitte optimiert.
3. Für in 10 % Formalin oder nicht quervernetztem Fixiermittel fixiertes Gewebe geeignet.
4. Nicht zur Verwendung in frischen Gefrierschnitten empfohlen.
Grenzwerte:
Die Qualität der extrahierten DNA steht in direktem Zusammenhang mit der Qualität des eingebetteten Gewebes. Bei unsanfter oder längerer Fixierung werden die Ergebnisse negativ beeinflusst.
Zusammenfassung und Prinzip
Das EX-WAX DNA-Extraktionskit eignet sich für in 10 % Formalin oder nicht quervernetzten Fixiermitteln fixiertes und in Paraffin eingebettetes Säugetiergewebe. Die DNA wird durch den Proteinverdau zugänglich. Die DNA wird solubilisiert und die verdauten Proteine werden „entsalzt“ und an den Röhrchenboden zentrifugiert. Die DNA wird ausgefällt, unter Vakuum getrocknet und erneut suspendiert. In Lösung ist die DNA schließlich für die Amplifikation mittels PCR geeignet.
Warnungen und Vorsichtshinweise
1. Beim Isolieren und Handhaben von DNA sind Handschuhe zu tragen, um die Aktivität der endogenen Nukleasen zu minimieren. Für zusätzlichen Schutz vor den Nukleasen autoklavierte Pipettenspitzen und 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen verwenden.
2. Die Volumina sind für fünf 5 μm dicke Gewebeschnitte optimiert.
3. Für in 10 % Formalin oder nicht quervernetztem Fixiermittel fixiertes Gewebe geeignet.
4. Nicht zur Verwendung in frischen Gefrierschnitten empfohlen.
Anwendung
Vorbereitung der Reagenzien
Proteinverdauenzymlösung
1,25 ml steriles destilliertes Wasser (im Lieferumfang enthalten) in das Fläschchen mit dem Proteinverdauenzympulver geben. Gründlich mischen. Nicht gebrauchte Lösungen bei -15 °C bis -25 °C aufbewahren.
Extraktionsverfahren
1. Das Gewebe in 5 μm dicke Schnitte teilen. Für jede Extraktion 3–5 Gewebeschnitte verwenden.
2. Paraffinreste abschneiden und die Gewebeschnitte in 1,5-ml-Röhrchen geben. Kurz zentrifugieren, um die Gewebeschnitte zu pelletisieren.
3. 1 ml frisches 100%iges Ethanol (Raumtemperatur) hinzugeben und 15 Sekunden lang vorsichtig vortexen.
4. 3 Minuten bei 12.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren.
5. Das Ethanol entfernen und das Pellet in einem Vakuumkonzentrator oder bei 60 °C 10 Minuten mit offener Kappe trocknen. Falls noch Ethanolreste vorhanden sind, weitere 10 Minuten trocknen.
6. 150 μl Verdaulösung und 50 μl Proteinverdauenzymlösung in das Röhrchen geben und durch Rühren mischen. Das Pellet mit dem Ende der Mikropipettiererspitze physisch in die Lösung mischen. Nicht in die Pipette aufziehen und wieder herausdrücken (da sich das Pellet dabei nicht auflöst).
7. Bei 50 °C mindestens 4 Stunden und maximal über Nacht inkubieren.
8. 100 μl Extraktionslösung zugeben und 15 Sekunden durch Umdrehen (mindestens 3 Mal) mischen. Bei zu starkem Mischen wird die DNA abgeschert.
9. 10 Minuten bei 12.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren. Den Überstand entfernen und in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen geben. Hierzu vorsichtig mit der Pipettenspitze durch die oben liegende Paraffinschicht stechen und den Überstand abziehen, sodass das Paraffin und das Pellet zurück bleiben (siehe Abbildung 1). Wenn geringe Paraffinmengen mit dem Überstand entfernt werden, wird die Extraktion dadurch nicht beeinträchtigt.
10. 150 μl Präzipationslösung zum Überstand geben, das Röhrchen 3 Mal umdrehen und anschließend 900 μl eiskaltes (-20 °C) 100%iges Ethanol zugeben. Das Röhrchen mit einer Kappe versehen und zum Mischen mehrmals umdrehen.
11. Mindestens 1 Stunde bei -20 °C ruhen lassen.
12. 10 Minuten bei 12.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
13. Das Pellet in einem Vakuumkonzentrator oder bei 60 °C 10 Minuten mit offener Kappe trocknen. Falls noch Ethanolreste vorhanden sind, weitere 10 Minuten trocknen.
14. 50 μl Resuspensionslösung zugeben und 1 Stunde bei 50 °C im Wasserbad inkubieren.
15. Für jede PCR-Reaktion 1 μl der resuspendierten DNA verwenden und Testläufe mit geeigneten PCR-Kontrollen durchführen.
Fehlerbehebung
1. Beim Resuspendieren der DNA in Resuspensionslösung darf die DNA nicht auf über 55 °C erwärmt werden. Dies würde zu einem Zerfall der DNA führen.
2. Wenn die PCR-Reaktion fehlschlägt, wie folgt auf das Vorhandensein und die Qualität der DNA prüfen: 10 μl der extrahierten Proben-DNA und Molekulargewichtsmarker auf einem Minigel mit 0,8 % Agarose unter Verwendung eines Kamms mit einem Zahnabstand von 3 mm analysieren. In einer Geltiefe von etwa 5 cm mit Bromophenolblau-Farbstoff markieren. Wenn keine Proben-DNA zu erkennen ist, versuchen, 10–40 μl Proben-DNA für die PCR-Reaktion hinzuzufügen oder mehr Gewebeschnitte zu extrahieren. Bei einer geringen Gewebemenge im Block mehr Gewebeschnitte extrahieren und bei sehr großen Gewebemengen kann versucht werden, den Versuch mit weniger Gewebe zu wiederholen.
Proteinverdauenzymlösung
1,25 ml steriles destilliertes Wasser (im Lieferumfang enthalten) in das Fläschchen mit dem Proteinverdauenzympulver geben. Gründlich mischen. Nicht gebrauchte Lösungen bei -15 °C bis -25 °C aufbewahren.
Extraktionsverfahren
1. Das Gewebe in 5 μm dicke Schnitte teilen. Für jede Extraktion 3–5 Gewebeschnitte verwenden.
2. Paraffinreste abschneiden und die Gewebeschnitte in 1,5-ml-Röhrchen geben. Kurz zentrifugieren, um die Gewebeschnitte zu pelletisieren.
3. 1 ml frisches 100%iges Ethanol (Raumtemperatur) hinzugeben und 15 Sekunden lang vorsichtig vortexen.
4. 3 Minuten bei 12.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren.
5. Das Ethanol entfernen und das Pellet in einem Vakuumkonzentrator oder bei 60 °C 10 Minuten mit offener Kappe trocknen. Falls noch Ethanolreste vorhanden sind, weitere 10 Minuten trocknen.
6. 150 μl Verdaulösung und 50 μl Proteinverdauenzymlösung in das Röhrchen geben und durch Rühren mischen. Das Pellet mit dem Ende der Mikropipettiererspitze physisch in die Lösung mischen. Nicht in die Pipette aufziehen und wieder herausdrücken (da sich das Pellet dabei nicht auflöst).
7. Bei 50 °C mindestens 4 Stunden und maximal über Nacht inkubieren.
8. 100 μl Extraktionslösung zugeben und 15 Sekunden durch Umdrehen (mindestens 3 Mal) mischen. Bei zu starkem Mischen wird die DNA abgeschert.
9. 10 Minuten bei 12.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren. Den Überstand entfernen und in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen geben. Hierzu vorsichtig mit der Pipettenspitze durch die oben liegende Paraffinschicht stechen und den Überstand abziehen, sodass das Paraffin und das Pellet zurück bleiben (siehe Abbildung 1). Wenn geringe Paraffinmengen mit dem Überstand entfernt werden, wird die Extraktion dadurch nicht beeinträchtigt.
10. 150 μl Präzipationslösung zum Überstand geben, das Röhrchen 3 Mal umdrehen und anschließend 900 μl eiskaltes (-20 °C) 100%iges Ethanol zugeben. Das Röhrchen mit einer Kappe versehen und zum Mischen mehrmals umdrehen.
11. Mindestens 1 Stunde bei -20 °C ruhen lassen.
12. 10 Minuten bei 12.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
13. Das Pellet in einem Vakuumkonzentrator oder bei 60 °C 10 Minuten mit offener Kappe trocknen. Falls noch Ethanolreste vorhanden sind, weitere 10 Minuten trocknen.
14. 50 μl Resuspensionslösung zugeben und 1 Stunde bei 50 °C im Wasserbad inkubieren.
15. Für jede PCR-Reaktion 1 μl der resuspendierten DNA verwenden und Testläufe mit geeigneten PCR-Kontrollen durchführen.
Fehlerbehebung
1. Beim Resuspendieren der DNA in Resuspensionslösung darf die DNA nicht auf über 55 °C erwärmt werden. Dies würde zu einem Zerfall der DNA führen.
2. Wenn die PCR-Reaktion fehlschlägt, wie folgt auf das Vorhandensein und die Qualität der DNA prüfen: 10 μl der extrahierten Proben-DNA und Molekulargewichtsmarker auf einem Minigel mit 0,8 % Agarose unter Verwendung eines Kamms mit einem Zahnabstand von 3 mm analysieren. In einer Geltiefe von etwa 5 cm mit Bromophenolblau-Farbstoff markieren. Wenn keine Proben-DNA zu erkennen ist, versuchen, 10–40 μl Proben-DNA für die PCR-Reaktion hinzuzufügen oder mehr Gewebeschnitte zu extrahieren. Bei einer geringen Gewebemenge im Block mehr Gewebeschnitte extrahieren und bei sehr großen Gewebemengen kann versucht werden, den Versuch mit weniger Gewebe zu wiederholen.
Komponenten
Ausreichend Reagenzien zur Durchführung von 20 DNA-Extraktionen mit drei bis fünf 5 μm dicken Gewebeschnitten pro Extraktion.
90442 Steril destilliertes Wasser (klar), 1,25 ml, Raumtemp.
90443 Verdaulösung, 3,0 ml, Raumemp.
90444 Extraktionslösung, 2,0 ml, Raumtemp.
90445 Präzipitationslösung, 3,0 ml, Raumtemp.
90446 Resuspensionslösung, 2,0 ml, Raumtemp.
90447 Proteinverdauenzym, 25 mg, -15 bis -25 °C
(Pulver)
90442 Steril destilliertes Wasser (klar), 1,25 ml, Raumtemp.
90443 Verdaulösung, 3,0 ml, Raumemp.
90444 Extraktionslösung, 2,0 ml, Raumtemp.
90445 Präzipitationslösung, 3,0 ml, Raumtemp.
90446 Resuspensionslösung, 2,0 ml, Raumtemp.
90447 Proteinverdauenzym, 25 mg, -15 bis -25 °C
(Pulver)
Rechtliche Hinweise
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Haftungsausschluss
Sofern in unserem Katalog oder anderen Begleitdokumenten unserer Produkte nicht anders angegeben, sind unsere Produkte nur für Forschungszwecke vorgesehen und nicht für andere Zwecke zu verwenden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf unautorisierte kommerzielle Verwendung, zur In-vitro-Diagnostik, für Ex-vivo- oder In-vivo-Therapiezwecke oder jegliche Art der Einnahme oder Anwendung bei Menschen oder Tieren.
Signalwort
Danger
H-Sätze
Gefahreneinstufungen
Eye Irrit. 2 - Resp. Sens. 1 - Skin Irrit. 2 - STOT SE 3
Zielorgane
Respiratory system
Lagerklassenschlüssel
10 - Combustible liquids
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In der Dokumentenbibliothek finden Sie die Dokumentation zu den Produkten, die Sie kürzlich erworben haben.
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No established chemotherapeutic regimen exists for the treatment of recurrent malignant gliomas (rMGs). Herein, we report the activity and safety results of the bevacizumab (B) plus fotemustine (FTM) combination for the treatment of rMGs. An induction phase consisted of B
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Epigenetic silencing of the MGMT (O6-methylguanine-DNA methyltransferase) DNA-repair gene by promoter methylation compromises DNA repair and has been associated with longer survival in patients with glioblastoma who receive alkylating agents. We tested the relationship between MGMT silencing in the tumor
Roger Stupp et al.
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Invasion and migration are key processes of glioblastoma and are tightly linked to tumor recurrence. Integrin inhibition using cilengitide has shown synergy with chemotherapy and radiotherapy in vitro and promising activity in recurrent glioblastoma. This multicenter, phase I/IIa study investigated
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In recurrent malignant gliomas (MGs), a high rate of haematological toxicity is observed with the use of fotemustine at the conventional schedule (100 mg/m(2) weekly for 3 consecutive weeks followed by triweekly administration after a 5-week rest period). Also, the
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