Klonierung & Expression

Proteinexpressionsvektoren

Plasmide, oder Proteinexpressionsvektoren, sind zirkuläre DNA-Stücke, die zahlreiche funktionelle Elemente zur Klonierung und Expression des gesuchten Proteins enthalten. Die Auswahl des geeigneten Expressionsvektors wird zum Teil durch die Proteinart, den Organismus, der das Protein exprimieren wird sowie die spezifische Anwendung und die zu klärenden wissenschaftlichen Fragen bestimmt. Die Vielzahl an verfügbaren Expressionsvektoren ermöglicht es Wissenschaftlern, die am besten für ihre Studie geeigneten Klonierungs-, Klonselektions- und Proteinexpressionselemente zu wählen. Nach der Auswahl der Gensequenz von Interesse und des Expressionsvektors verwenden Wissenschaftler häufig Nukleasen, um den Vektor an spezifischen Stellen präzise zu schneiden, damit die gewählte Gensequenz im Leserahmen kloniert und schließlich in einem Wirtsorganismus exprimiert werden kann. Wichtig ist dabei, dass häufig chemisch kompetente Zellen und bakterielle Transformation eingesetzt werden, um die rekombinanten DNA-Plasmide aufzunehmen, da sie in gefrorenem Zustand bei -70 °C stabil sind.

Transfektion von Zellen

Zelltransfektion ist der Prozess des Einbringens von DNA, RNA oder Proteinen in eukaryotische Zellen. Wissenschaftlern stehen verschiedene physikalische, chemische und biologische Technologien zur Verfügung, um diesen Arbeitsschritt der Proteinexpression durchzuführen. Physikalische Methoden wie Elektroporation oder chemische Methoden wie Calciumphosphat (CaPi), Polyethylenimin (PEI) and Lipofektionsreagenzien werden häufig eingesetzt. Virale Transduktionssysteme, einschließlich lentiviraler, onkoretroviraler und adenoviraler Systeme, stehen ebenfalls zur Verfügung. Die Anwendung viraler Transportmethoden erfordert jedoch oftmals zusätzliche Eindämmungs- und Überwachungsmaßnahmen aus Gründen der biologischen Sicherheit.

Proteinexpressionssysteme

Wissenschaftler setzen verschiedene Organismen zur Expression des sie interessierenden Proteins ein. Bakterien werden häufig verwendet, da sie Expressionsvektoren effizient aufnehmen, kurze Verdopplungszeiten aufweisen und große Mengen rekombinanter Proteine unter optimalen Bedingungen produzieren können. Bakterien sind jedoch prokaryotische Organismen und daher nicht in der Lage, posttranslationale Proteinmodifikationen bereitzustellen, die manche Proteine erfordern. Eukaryotische Zellen, einschließlich Hefe- und Säugerzelllinien, erleichtern posttranslationale Proteinmodifikation und werden auch häufig von Wissenschaftlern verwendet. Die Auswahl der besten Zelllinie für die rekombinante Proteinexpression und der Proteinexpressionsstrategie hängt in hohem Maß von den spezifischen Anwendungsanforderungen und den zu klärenden wissenschaftlichen Fragen ab.