RPOLSP6-RO

SP6-RNA-Polymerase

from Escherichia coli BL 21/pSR3

• Synonym(e): Polymerase, mRNA
• UNSPSC Code: 12352204
• NACRES: NA.54
• Specific activity: ≥20 U/μL
• Assay: 100% (SDS-PAGE)
• Biological source: Escherichia coli (BL 21/pSR3)

Eigenschaften

• biological source: Escherichia coli (BL 21/pSR3)
• assay: 100% (SDS-PAGE)
• form: solution
• specific activity: ≥20 U/μL
• mol wt: 96 kDa (Single polypeptide chain)
• packaging: pkg of 1,000 U (10810274001), pkg of 5,000 U (11487671001)
• manufacturer/tradename: Roche
• technique(s): DNA sequencing: suitable, Northern blotting: suitable, Southern blotting: suitable
• color: colorless
• pH: ~7.9 (39 °F)
• solubility: water: miscible
• suitability: suitable for molecular biology
• UniProt accession no.: P0A8V2
• application(s): genomic analysis; life science and biopharma
• foreign activity: Endonucleases, none detected (up to 30U using Lamda-DNA), Endonucleases, none detected (upto 30U using MWM III-DNA ), Nicking activity, none detected (up to 30U using pBR322-DNA), RNase, none detected (up to 30U using MS II- RNA )
• storage temp.: −20°C
• Gene Information: Escherichia coli ... rpoB(948488)

Beschreibung

General description

Mit diesem System kann homogen markierte Einzelstrang-RNA hergestellt werden. Transkripte können nicht-radioaktiv mit Biotin oder DIG-11-UTP bzw. radioaktiv bis zu einer hochspezifischen Aktivität mit [α-³²P]- oder [α-³⁵S]-markierten Nukleotiden markiert werden.

Inhalt:

• SP6-RNA-Polymerase, ≥20 U/μL, in Puffer, pH 7,9
• Transkriptionspuffer, zehnfach konzentriert

Application

SP6-RNA-Polymerase kann RNA von hinter einem SP6-Promotor klonierten DNA-Templates transkribieren. Die Synthese kann mit markierten NTPs durchgeführt werden, um hochmarkierte RNA herzustellen. Synthetisierte RNA kann in vielen Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich:

• RNA- oder DNA-Blotting-Techniken
• In-situ-Hybridisierung[1][2][3]
• RNase-Schutzstudien: Vom Enzym synthetisierte Transkripte werden als prä-RNA für Studien zu RNA-Spleißen und -Verarbeitung verwendet.
• Synthese von RNA mit Cap-Struktur in vitro unter Zugabe von m7GpppG oder m7GpppA über GTP oder ATP während der Transkriptionsreaktion. Die generierte Antisense-DNA kann in Zellen eingeführt werden, um die Expression der entsprechenden Gene zu unterdrücken.
• Die Synthese von Antisense-RNA-Sonden[4]

Biochem/physiol Actions

Promotorspezifität

SP6-RNA-Polymerase ist extrem promotorspezifisch und transkribiert nur Bakteriophage-SP6-DNA oder hinter einem SP6-Promotor klonierte DNA (z. B. pSPTBM20; pSPTBM21).

Hitzeinaktivierung: Die Reaktion wird durch Zugabe von 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8,0) bzw. Erwärmung auf 65 °C gestoppt.

Features and Benefits

Synthese von Hybridisierungssonden: SP6-RNA-Polymerase ermöglicht die hocheffiziente Produktion von homogen markierter RNA. Diese markierte RNA kann als Hybridisierungssonden in Southern, Northern und Dot Blots sowie In-situ-Hybridisierungen verwendet werden.
Geeignete Markierungen: Transkripte können nicht-radioaktiv mit Biotin-16-UTP, DIG-11-UTP oder Fluorescein-12-UTP markiert werden. Sie können radioaktiv bis zu einer hochspezifischen Aktivität mit [a-³²P]- oder [a-³⁵S]-markierten Nukleotiden markiert werden.

Hinweis: Roche hat 10x konzentrierte RNA-Markierungsmischungen, die spezifisch für die DIG-, Biotin- oder Fluorescein-Markierung konzipiert wurden. Diese Mischungen funktionieren gut mit SP6-RNA-Polymerase.

Preparation Note

Aktivator: BSA/Spermin

Behälter dicht verschlossen an einem trockenen und gut belüfteten Ort aufbewahren.

Analysis Note

Testpuffer
40 mM Tris-HCl, pH 8,0 (+20 °C), 6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 2 mM Spermidin, pH ungefähr 8,0 (+20 °C).
Abwesenheit von Endonukleasen
1. 1 μg Lambda-DNA wird 4 Stunden lang bei +37 °C mit SP6-RNA-Polymerase in 25 μL Testpuffer inkubiert. Die Anzahl der Enzymeinheiten, die keine Zersetzung der Lambda-DNA aufweisen, liegt bei > 30 U.
2. 1 μg EcoRI-/Hind-III-Fragmente von Lambda-DNA werden 4 Stunden lang bei +37 °C mit SP6-RNA-Polymerase in 25 μL Testpuffer inkubiert. Die Anzahl der Enzymeinheiten, die keine Änderung des Bandenmusters aufweisen, liegt bei > 30 U.
Abwesenheit von Nicking-Aktivität
1 μg pBR322-DNA wird 4 Stunden lang bei +37 °C mit SP6-RNA-Polymerase in 25 μL Testpuffer inkubiert. Die Anzahl der Enzymeinheiten, die keine Entspannung der Supercoil-Struktur aufweisen, liegt bei > 30 U.
Abwesenheit von RNasen
4 μg MS2-RNA werden 4 Stunden lang bei +37 °C mit SP6-RNA-Polymerase in 50 μL Testpuffer inkubiert. Die Anzahl der Enzymeinheiten, die keine Zersetzung der MS2-RNA aufweisen, liegt bei > 30 U.
Leistung bei Transkriptions-Assays
SP6-RNA-Polymerase wird im SP6/T7-Transkriptions-Kit (Bestell- Nr. 10 999 644 001) einem Funktionstest unterzogen. Die Beimischungsquote im Standard-Assay mit 0,5 μg pST18-neo-DNA linearisiert mit EcoRI und 50 mCi [alpha-^32P] CTP, [400 Ci/mmol (15 TBq/mmol)] erzeugt >50 % der Eingangsradioaktivität in 20 Minuten.

Other Notes

Eine Einheit ist die Enzymaktivität, die 1 nmol CMP innerhalb von 60 Minuten bei +37 °C in säurefällbare RNA einbaut.

Volumenaktivität: ≥20 U/μL

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht für den Einsatz in diagnostischen Verfahren geeignet.

Nur Kit-Komponenten

• SP6 RNA Polymerase, in buffer, pH 7.9 ≥20 U/μl
• Transcription Buffer 10x concentrated

Sicherheitshinweise

• pictograms: GHS07
• signalword: Warning
• hcodes: H319
• pcodes: P264 - P280 - P305 + P351 + P338 - P337 + P313
• Hazard Classifications: Eye Irrit. 2
• Lagerklasse: 12 - Non Combustible Liquids
• wgk: WGK 1
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