RPOLT7-RO

T7-RNA-Polymerase

from Escherichia coli BL 21/pAR 1219

• Synonym(e): Polymerase
• UNSPSC Code: 12352204
• EG-Nummer: 2.7.7.6 (BRENDA, IUBMB)
• NACRES: NA.54
• Specific activity: ≥20 U/μL
• Assay: 100% (SDS-PAGE)
• Biological source: Escherichia coli (BL 21/pAR 1219)

Eigenschaften

• biological source: Escherichia coli (BL 21/pAR 1219)
• assay: 100% (SDS-PAGE)
• form: solution
• specific activity: ≥20 U/μL
• mol wt: 98 kDa (Single polypeptide chain)
• packaging: pkg of 1,000 U (10881767001), pkg of 5,000 U (10881775001)
• manufacturer/tradename: Roche
• technique(s): Northern blotting: suitable, Southern blotting: suitable, hybridization: suitable
• color: colorless
• pH: 7.9 (39 °F)
• solubility: water: miscible
• suitability: suitable for molecular biology
• NCBI accession no.: ACY75835
• UniProt accession no.: P00573
• application(s): life science and biopharma
• foreign activity: Endonucleases 100 units, none detected, Nicking activity 100 units, none detected, RNase 100 units, none detected
• storage temp.: −20°C
• Gene Information: Escherichia coli ... T7p07(1261050)

Beschreibung

General description

T7-RNA-Polymerase wird gewöhnlich zur Transkription von DNA verwendet, die in Vektoren mit zwei Phagen-Promotoren in entgegengesetzte Richtung kloniert wurde. RNA kann selektiv von beiden Strängen der eingebauten DNA aus mit unterschiedlichen Polymerasen synthetisiert werden. Mit diesem System kann homogen markierte Einzelstrang-RNA hergestellt werden. Transkripte können nicht-radioaktiv mit Biotin oder DIG-11-UTP bzw. radioaktiv bis zu einer hochspezifischen Aktivität mit [α-³²P]- oder [α-³⁵S]-markierten Nukleotiden markiert werden.

Synthese von Hybridisierungssonden: T7-RNA-Polymerase ermöglicht die hocheffiziente Produktion von homogen markierter RNA. Diese markierte RNA kann als Hybridisierungssonden in Southern, Northern und Dot Blots sowie In-situ-Hybridisierungen verwendet werden.
Geeignete Markierungen:Transkripte können nicht-radioaktiv mit Biotin-16-UTP oder DIG-11-UTP markiert werden. Sie können auch radioaktiv bis zu einer hochspezifischen Aktivität mit [α-32P]- oder [α-35S]-markierten Nukleotiden markiert werden.

Application

• T7-RNA-Polymerase kann RNA von hinter einem T7-Promotor klonierten DNA-Templates transkribieren. Die Synthese kann mit markierten NTPs durchgeführt werden, um hochmarkierte RNA herzustellen.[1] Synthetisierte RNA kann in vielen Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich: RNA- oder DNA-Blotting-Techniken
• In-situ-Hybridisierung[2]
• RNase-Schutzstudien: Vom Enzym synthetisierte Transkripte werden als prä-RNA für Studien zu RNA-Spleißen und -Verarbeitung verwendet.
• Synthese von RNA mit Cap-Struktur in vitro unter Zugabe von m7GpppG oder m7GpppA über GTP oder ATP während der Transkriptionsreaktion. Die generierte Antisense-DNA kann in Zellen eingeführt werden, um die Expression der entsprechenden Gene zu unterdrücken.
• Microarray-Zielsynthese

Biochem/physiol Actions

Promotorspezifität
T7-RNA-Polymerase ist extrem promotorspezifisch und transkribiert nur Bakteriophage-T7-DNA oder hinter einem T7-Promotor klonierte DNA. Obwohl sich die T7- und T3-Promotorsequenzen nur um 3 Basenpaare unterscheiden, transkribiert T7-RNA-Polymerase nur hinter ihrem Promotor klonierte DNA
Hitzeinaktivierung: Die Reaktion wird durch Zugabe von 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8,0) bzw. Erwärmung auf 65 °C gestoppt.

Packaging

1 Kit mit 2 Komponenten

Preparation Note

Aktivator: Die T7-RNA-Polymerasen werden durch BSA oder Spermidin stark stimuliert.

Behälter dicht verschlossen an einem trockenen und gut belüfteten Ort aufbewahren.

Other Notes

Testpuffer
40 mM Tris-HCl, pH 8,0 (+20 °C), 6 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 2 mM Spermidin, pH ungefähr 8,0 (+20 °C).
Abwesenheit von Endonukleasen
1. 1 μg Lambda-DNA wird 4 Stunden lang bei +37 °C mit T7-RNA-Polymerase in 25 μL Testpuffer inkubiert. Die Anzahl der Enzymeinheiten, die keine Zersetzung der Lambda-DNA aufweisen, liegt bei >100 U.
2. 1 μg EcoRI-/HindIII-Fragmente von Lambda-DNA werden 4 Stunden lang bei +37 °C mit T7-RNA-Polymerase in 25 μL Testpuffer inkubiert. Die Anzahl der Enzymeinheiten, die keine Änderung des Bandenmusters aufweisen, liegt bei >100 U.
Abwesenheit von Nicking-Aktivität
1 μg pBR322-DNA wird 4 Stunden lang bei +37 °C mit T7-RNA-Polymerase in 25 μL Testpuffer inkubiert. Die Anzahl der Enzymeinheiten, die keine Entspannung der Supercoil-Struktur aufweisen, liegt bei >100 U.
Abwesenheit von RNasen
4 μg MS2-RNA werden 4 Stunden lang bei +37 °C mit T7-RNA-Polymerase in 50 μL Testpuffer inkubiert. Die Anzahl der Enzymeinheiten, die keine Zersetzung der MS2-RNA aufweisen, liegt bei >100 U.
Leistung bei Transkriptions-Assays
T7-RNA-Polymerase wird im SP6/T7-Transkriptions-Kit (Bestell- Nr. 10 999 644 001) einem Funktionstest unterzogen. Die Beimischungsquote im Standard-Assay mit 0,5 μg pSPT19-neo-DNA linearisiert mit EcoRI und 50 mCi [alpha-32P] CTP, [400 Ci/mmol (15 TBq/mmol)] erzeugt >50 % der Eingangsradioaktivität in 20 Minuten.

Eine Einheit ist die Enzymaktivität, die 1 nmol CMP innerhalb von 60 Minuten bei +37 °C in säurefällbare RNA einbaut.

Volumenaktivität: ≥20 U/μL

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.
Roche hat 10x konzentrierte RNA-Markierungsmischungen, die spezifisch für die DIG- oder Biotin-Markierung konzipiert wurden. Diese Mischungen funktionieren gut mit T7-RNA-Polymerase.

Nur Kit-Komponenten

• T7 RNA Polymerase, in buffer, pH 7.9 ≥20 U/μl
• Transcription Buffer 10x concentrated

Sicherheitshinweise

• pictograms: GHS07
• signalword: Warning
• Lagerklasse: 12 - Non Combustible Liquids
• wgk: WGK 2
• flash_point_f: does not flash
• flash_point_c: does not flash
• hcodes: H317,H319
• pcodes: P261 - P280 - P333 + P313 - P337 + P313 - P362 + P364 - P501
• Hazard Classifications: Eye Irrit. 2 - Skin Sens. 1