The optimal protein concentration needed for the assay is sample dependent and should be empirically determined via titration/dilution of the protein sample. For use of Suc-LLVY-AMC substrate on heart samples, one may consider homogenizing using 10 volumes of HEPES buffer (50 mmol/L) containing 20 mmol/L KCl, 5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L DTT, pH 7.5, followed up with centrifugation at 10,000×g for 30 min. at 4 °C. Under this condition, 30 ug protein per assay seems to work well as described by the following publication that may be of interest for reference:
APT280
20S-Proteasom-Aktivitäts-Assay
Synonym(e):
20S-Proteasomen-Assay, Proteasom-Aktivitätsassay-Kit, Proteasomen-Assay, Proteasomenaktivität-Kit
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About This Item
UNSPSC-Code:
12161503
eCl@ss:
32161000
NACRES:
NA.84
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Empfohlene Produkte
Allgemeine Beschreibung
Einleitung:
Der Ubiquitin-Proteasom-Signalweg ist das wichtigste proteolytische System im Cytosol eukaryotischer Zellen, wo er den selektiven Abbau kurzlebiger regulatorischer Proteine und die schnelle Beseitigung von Proteinen mit abnormer Konformation katalysiert (Hershko & Ciechanover 1998; Hochstrasser 1996). Die kritische Protease in diesem Signalweg ist das 26S-Proteasom, ein ATP-abhängiger proteolytischer Komplex, der durch die Verbindung des zylinderförmigen 20S-Proteasoms (700 kDa) und zweier regulatorischer 19S-Komplexe (700 kDa) gebildet wird (Baumeister et al. 1998; Coux et al. 1996). Das 20S-Proteasom, der katalytische Kern des Proteasomkomplexes, ist für die Aufspaltung der wichtigsten Proteine verantwortlich, die mit Apoptose, DNA-Reparatur, Endozytose und Zellzykluskontrolle verbunden sind (Coux et al. 1996; Hoffman & Rechsteiner 1996; Hochwasser 1995). Das Proteasom-Aktivitäts-Assay-Kit von CHEMICON® ist ein schnelles, effizientes und empfindliches System zur Bewertung der Proteasom-Aktivität in Zelllysaten sowie zum Screening von Hemmstoffen.
Testprinzip:
Das Proteasom-Aktivitäts-Assay-Kit von CHEMICON′ bietet eine einfache und bequeme Möglichkeit zur Untersuchung der Aktivität von Proteasomen, die das Substrat LLVY erkennen (Meng et al. 1999). Der Test basiert auf dem Nachweis des Fluorophors 7-Amino-4-Methylcoumarin (AMC) nach der Abspaltung vom markierten Substrat LLVY-AMC. Absorption = 351 nm. Emission = 430 nm. Die Fluoreszenz des freien AMCs kann mit einem 380/460-nm-Filter in einem Fluorometer quantifiziert werden.
Für Screeningzwecke ist ein Proteasominhibitor (Lactacystin) als Testinhibitor beigefügt. Lactacystin ist ein von Mikroben synthetisiertes Naturprodukt und der spezifischste und wirksamste Inhibitor von Proteasomen, der derzeit bekannt ist (Fenteany und Schreiber 1998).
Anwendung:
Das Proteasom-Aktivitäts-Assay-Kit bietet eine relativ schnelle Methode zur Erkennung intrazellulärer Proteasom-Aktivität. Dieser Assay ermöglicht außerdem die Prüfung aufgereinigter Proteasom-Enzyme, das In-vitro-Screening von Inhibitoren und die Untersuchung der Proteasom-Regulierung.
Das Proteasom-Aktivitäts-Assay-Kit von CHEMICON ist nur für Forschungszwecke vorgesehen, nicht für diagnostische oder therapeutische Anwendungen.
Der Ubiquitin-Proteasom-Signalweg ist das wichtigste proteolytische System im Cytosol eukaryotischer Zellen, wo er den selektiven Abbau kurzlebiger regulatorischer Proteine und die schnelle Beseitigung von Proteinen mit abnormer Konformation katalysiert (Hershko & Ciechanover 1998; Hochstrasser 1996). Die kritische Protease in diesem Signalweg ist das 26S-Proteasom, ein ATP-abhängiger proteolytischer Komplex, der durch die Verbindung des zylinderförmigen 20S-Proteasoms (700 kDa) und zweier regulatorischer 19S-Komplexe (700 kDa) gebildet wird (Baumeister et al. 1998; Coux et al. 1996). Das 20S-Proteasom, der katalytische Kern des Proteasomkomplexes, ist für die Aufspaltung der wichtigsten Proteine verantwortlich, die mit Apoptose, DNA-Reparatur, Endozytose und Zellzykluskontrolle verbunden sind (Coux et al. 1996; Hoffman & Rechsteiner 1996; Hochwasser 1995). Das Proteasom-Aktivitäts-Assay-Kit von CHEMICON® ist ein schnelles, effizientes und empfindliches System zur Bewertung der Proteasom-Aktivität in Zelllysaten sowie zum Screening von Hemmstoffen.
Testprinzip:
Das Proteasom-Aktivitäts-Assay-Kit von CHEMICON′ bietet eine einfache und bequeme Möglichkeit zur Untersuchung der Aktivität von Proteasomen, die das Substrat LLVY erkennen (Meng et al. 1999). Der Test basiert auf dem Nachweis des Fluorophors 7-Amino-4-Methylcoumarin (AMC) nach der Abspaltung vom markierten Substrat LLVY-AMC. Absorption = 351 nm. Emission = 430 nm. Die Fluoreszenz des freien AMCs kann mit einem 380/460-nm-Filter in einem Fluorometer quantifiziert werden.
Für Screeningzwecke ist ein Proteasominhibitor (Lactacystin) als Testinhibitor beigefügt. Lactacystin ist ein von Mikroben synthetisiertes Naturprodukt und der spezifischste und wirksamste Inhibitor von Proteasomen, der derzeit bekannt ist (Fenteany und Schreiber 1998).
Anwendung:
Das Proteasom-Aktivitäts-Assay-Kit bietet eine relativ schnelle Methode zur Erkennung intrazellulärer Proteasom-Aktivität. Dieser Assay ermöglicht außerdem die Prüfung aufgereinigter Proteasom-Enzyme, das In-vitro-Screening von Inhibitoren und die Untersuchung der Proteasom-Regulierung.
Das Proteasom-Aktivitäts-Assay-Kit von CHEMICON ist nur für Forschungszwecke vorgesehen, nicht für diagnostische oder therapeutische Anwendungen.
Anwendung
Das Proteasom-Aktivitäts-Assay-Kit bietet eine einfache und praktische Methode zur Analyse der der Aktivität von Proteasomen, die die LLVY-Sequenz erkennen.
Lysepuffer: 50 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl und 1 % Triton X-100. Die Zugabe von 2 mM ATP zum Lysat verbessert die Rückgewinnung von intaktem 26S-Proteasom.
Siehe auch: Hoffman, L. 1992 unter http://www.jbc.org/cgi/reprint/267/31/22362.pdf
Siehe auch: Hoffman, L. 1992 unter http://www.jbc.org/cgi/reprint/267/31/22362.pdf
Sonstige Hinweise
Sofern in unserem Katalog oder anderen Begleitdokumenten unserer Produkte nicht anders angegeben, sind unsere Produkte nur für Forschungszwecke vorgesehen und nicht für andere Zwecke zu verwenden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf unautorisierte kommerzielle Zwecke.
Rechtliche Hinweise
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
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10 - Combustible liquids
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Could you please provide clarification on the protocol for the 20S Proteasome activity assay (APT280)? The protocol does not specify the protein concentration or the buffer for diluting the sample. Additionally, I need guidance on homogenizing and diluting heart samples for the assay. What buffer should I use for homogenization and dilution?
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