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Katalase-Assay-Kit

• Synonym(e): Catalase-Aktivitäts-Assay-Kit
• NACRES: NA.84
• UNSPSC Code: 41116133

Eigenschaften

• usage: sufficient for 96 tests
• Quality Segment: 100
• specific activity: 0.25 - 4 nmol/min⋅mL
• packaging: pkg of 1 96-well plate(s)
• manufacturer/tradename: Calbiochem^®
• storage condition: OK to freeze
• input: sample type cell lysate; sample type tissue homogenate(s); sample type erythrocyte lysate; sample type plasma; sample type serum
• detection method: colorimetric
• storage temp.: 2-8°C

Beschreibung

General description

Ein sensitiver spektrofotometrischer Assay (540 nm) zum Messen der Katalase(CAT)-Aktivität in Plasma, Serum, Erythrozytenlysaten, Gewebehomogenaten und Zelllysaten. Assaybereich: 0,25–4 nmol/min/ml. Enthält ausreichend Reagenzien für 96 Tests.

Preparation Note

• 1X-Assaypuffer: Verdünnen Sie 2 ml 10X-Assaypuffer-Konzentrat mit 18 ml Wasser in HPLC-Qualität. Der resultierende 1X-Assaypuffer (100 mmol/l Kaliumphosphat, pH-Wert 7,0) sollte im Assay verwendet werden. Wenn er bei 4 °C gelagert wird, ist der verdünnte 1X-Assaypuffer mindestens zwei Monate haltbar.• 1X-Probenpuffer: Verdünnen Sie 5 ml 10X-Probenpuffer-Konzentrat mit 45 ml Wasser in HPLC-Qualität. Der resultierende 1X-Probenpuffer (25 mmol/l Kaliumphosphat, pH-Wert 7,5, mit 1 mmol/l EDTA und 0,1 % BSA) sollte zum Verdünnen von Formaldehydstandard, Katalase (Kontrolle) und Proben vor dem Assay verwendet werden. Wenn er bei 4 °C gelagert wird, ist der verdünnte 1X-Probenpuffer mindestens zwei Monate haltbar.• Formaldehydstandard: Ein Fläschchen mit 4,25 mol/l Formaldehyd. Das Reagens ist wie geliefert gebrauchsfertig.• Katalase (Kontrolle): Dieses Fläschchen enthält ein lyophilisiertes Pulver von Rinderleber-Katalase (CAT) und wird als Positivkontrolle eingesetzt. Rekonstituieren Sie die CAT, indem Sie 2 ml 1X-Probenpuffer zu dem Fläschchen geben und gründlich vortexen. Nehmen Sie 100 µl des rekonstituierten Enzyms und verdünnen Sie es mit 1,9 ml 1X-Probenpuffer. Ein 20-µl-Aliquot dieses verdünnten Enzyms je Well löst eine Absorption von ~0,29 nach Abzug der Hintergrundabsorption aus. Das verdünnte Enzym ist 30 min stabil. Die rekonstituierte CAT ist bei -20 °C einen Monat haltbar.• Kaliumhydroxid: Das Fläschchen enthält Kaliumhydroxid(KOH)-Pellets. Legen Sie ein Fläschchen auf Eis, geben Sie 4 ml kaltes Wasser in HPLC-Qualität dazu und vortexen Sie es, um eine 10-mol/l-Lösung zu erhalten. [ACHTUNG: Wenn Kaliumhydroxidpellets in Wasser gelöst werden, wird Wärme erzeugt. Die KOH-Lösung ist bei einer Lagerung bei 4 °C mindestens drei Monate haltbar.]• Wasserstoffperoxid: Dieses Fläschchen enthält eine 8,82-mol/l-Lösung von Wasserstoffperoxid. Verdünnen Sie 40 µl Wasserstoffperoxid mit 9,96 ml Wasser in HPLC-Qualität. Die verdünnte Wasserstoffperoxidlösung ist 2 h stabil.• Purpald (Chromogen): Dieses Fläschchen enthält eine Lösung von 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol (Purpald) in 0,5 mol/l Salzsäure. Das Reagens ist wie geliefert gebrauchsfertig.• Kaliumperiodat: Dieses Fläschchen enthält eine Lösung von Kaliumperiodat in 0,5 mol/l Kaliumhydroxid. Das Reagens ist wie geliefert gebrauchsfertig.

Hinweis: Überhitzen kann die Katalase inaktivieren. Das Enzym sollte während der Probenvorbereitung und Durchführung des Assays kalt gehalten werden. Allgemein ist stark verdünnte Katalase sehr instabil. Es wird empfohlen, die Proben konzentriert zu lagern und innerhalb von 30 Minuten nach der Verdünnung in einem Assay zu verwenden. A. Gewebehomogenate 1. Das Gewebe vor der Dissektion entweder perfundieren oder mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4, spülen, um alle Erythrozyten und Gerinnsel zu entfernen. 2. Das Gewebe auf Eis in 5–10 ml kaltem Puffer (d. h. 50 mmol/l Kaliumphosphat, pH-Wert 7,0, mit 1 mmol/l EDTA) je Gramm Gewebe homogenisieren. 3. Bei 4 °C und 10.000 x g für 15 min zentrifugieren. 4. Entfernen Sie den Überstand für einen Assay und lagern Sie ihn auf Eis. Sollte der Assay nicht am gleichen Tag durchgeführt werden, frieren Sie die Probe bei -80 °C ein. Die Probe ist mindestens einen Monat haltbar.B. Zelllysate 1. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren (d. h. 1000–2000 x g für 10 min bei 4 °C). Entnehmen Sie adhärente Zellen nicht mit proteolytischen Enzymen, sondern verwenden Sie stattdessen einen Gummiwischer. 2. Homogenisieren oder beschallten Sie den Zellrückstand auf Eis in 1–2 ml kaltem Puffer (d. h. 50 mmol/l Kaliumphosphat, pH-Wert 7,0, mit 1 mmol/l EDTA). 3. Bei 4 °C und 10.000 x g für 15 min zentrifugieren. 4. Entfernen Sie den Überstand für einen Assay und lagern Sie ihn auf Eis. Sollte der Assay nicht am gleichen Tag durchgeführt werden, frieren Sie die Probe bei -80 °C ein. Die Probe ist mindestens einen Monat haltbar. C. Plasma und Erythrozytenlysate 1. Entnehmen Sie Blut mit einem Gerinnungshemmer wie Heparin, Citrat oder EDTA. 2. Bei 4 °C und 700–1000 x g für 10 min zentrifugieren. Die obere gelbe Plasmaschicht pipettieren, ohne den weißen Buffy-Coat aufzuwirbeln. Lagern Sie das Plasma bis zum Assay auf Eis oder frieren es bei -80 °C ein. Die Plasmaprobe ist mindestens einen Monat haltbar. 3. Entfernen Sie den weißen Buffy-Coat (Leukozyten) und entsorgen Sie ihn. 4. Lysen Sie die Erythrozyten (rote Blutkörperchen) im vierfachen gepackten Volumen mit eiskaltem Wasser in HPLC-Qualität. 5. Bei 4 °C und 10.000 x g für 15 min zentrifugieren. 6. Sammeln Sie den Überstand (Erythrozytenlysat) für einen Assay und lagern Sie ihn auf Eis. Sollte der Assay nicht am gleichen Tag durchgeführt werden, frieren Sie ihn bei -80 °C ein. Die Probe ist mindestens einen Monat haltbar.D. Serum 1. Entnehmen Sie Blut mit einem Gerinnungshemmer wie Heparin, Citrat oder EDTA. Lassen Sie das Blut bei 25 °C 30 min gerinnen. 2. Zentrifugieren Sie das Blut bei 4 °C und 2000 x g für 15 min. Pipettieren Sie die obere gelbe Serumschicht, ohne den weißen Buffy-Coat aufzuwirbeln. Lagern Sie das Serum auf Eis. Sollte der Assay nicht am gleichen Tag durchgeführt werden, frieren Sie ihn bei -80 °C ein. Die Probe ist mindestens einen Monat haltbar.

Bei Empfang den gesamten Inhalt des Kits bei 4 °C lagern.

Analysis Note

Berechnung der Ergebnissea. Berechnen Sie die mittleren Absorptionen jedes Standards und jeder Probe. b. Ziehen Sie die mittlere Absorption von Standard A von sich selbst und allen anderen Standards und Proben ab. c. Zeichnen Sie die korrigierte Absorption der Standards (aus dem vorstehenden Schritt 2) als Funktion der Endkonzentration (M) von Formaldehyd aus Tabelle 1 auf. Siehe Abbildung 1 (nachstehend) für eine typische Standardkurve.<div class="Bio_doc_image">
Abbildung 2: Typische Formaldehydstandardkurve:
</div>d. Berechnen Sie die Formaldehydkonzentration der Proben mit der Gleichung, die aus der linearen Regression der Standardkurve durch Einsetzen der korrigierten Absorptionswerte für jede Probe erhalten wird.<div class="Bio_doc_image">
Abbildung 3: Formaldehydkonzentrationsgleichung</div>
e. Berechnen Sie die Katalaseaktivität der Probe mithilfe der folgenden Gleichung. Eine Einheit ist als die Menge an Enzym, die je Minute bei 25°C die Bildung von 1,0 nmol Formaldehyd verursacht, definiert.<div class="Bio_doc_image">Abbildung 4: Aktivitätsgleichung</div>

Other Notes

Assaypuffer, Probenpuffer, Formaldehydstandard, Katalase, Kaliumhydroxid, Methanol, Wasserstoffperoxid, Purpald (Chromogen), Kaliumperiodat, 96-Well-Mikrotiterplatte, Plattenabdeckung

Aufgrund der Beschaffenheit der in dieser Lieferung enthaltenen Gefahrgüter können zusätzliche Versandkosten bei Ihrer Bestellung anfallen. Bestimmte Größen sind ggf. von den Versandzuschlägen für Gefahrgüter ausgenommen. Um weitere Informationen über diese Versandzuschläge zu erhalten, kontaktieren Sie bitte Ihren lokalen Vertrieb.

Wheeler, C.R., et al. 1990. Anal. Biochem.184, 193;
Johansson, L.H., et al. 1988. Anal. Biochem.174, 331.

Legal Information

CALBIOCHEM is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Disclaimer

Toxizität: Mehrere Toxizitätswerte, siehe MSDS (O)

Sicherheitshinweise

• pictograms: GHS03,GHS06,GHS08,GHS05
• signalword: Danger
• hcodes: H271,H290,H302,H314,H317,H331,H334,H335,H341,H350,H372,H412
• pcodes: P210 - P273 - P280 - P303 + P361 + P353 - P304 + P340 + P310 - P305 + P351 + P338
• Hazard Classifications: Acute Tox. 3 Inhalation - Acute Tox. 4 Oral - Aquatic Chronic 3 - Carc. 1B - Eye Dam. 1 - Met. Corr. 1 - Muta. 2 - Ox. Liq. 1 - Resp. Sens. 1 - Skin Corr. 1A - Skin Sens. 1 - STOT RE 1 - STOT SE 3
• target_organs: Respiratory system, Thyroid
• Lagerklasse: 5.1A - Strongly oxidizing hazardous materials
• wgk: WGK 3