Ugrás a tartalomra
Merck
KezdőlapKlónozás és expresszióRekombináns kiválasztás

Rekombináns kiválasztás

Oxford Genetics logó

Kék-fehér szűrés

A kék-fehér kolóniák szűrése egy olyan stratégia, amely gyorsan és egyszerűen megkülönbözteti a rekombináns és nem rekombináns kolóniákat. Ehhez egy speciális vektorra és egy speciális E. coli törzsre van szükség. Különösen hasznos az olyan trükkös klónozási stratégiáknál, mint a tompa végű klónozás vagy a DNS-könyvtárkészítés. A szűrés elvégzéséhez szükséges reagensek elkészítéséhez használhatjuk az alábbi protokollt, vagy megvásárolhatjuk a kész Blue White Screening Reagent (Catalog  No. B2928).

Hogyan működik a kékfehér szűrés

Az első gén a E. coli lac-operon a lacZ, amely a β-galaktozidázt (β-gal) kódolja. A β-gal aktív formája egy tetramer, és a laktózt glükózzá és galaktózzá hidrolizálja. A β-gal 11-41 aminosavainak törlése (az úgynevezett lacZΔM15 mutáció) azt jelenti, hogy az enzim nem képes tetramert alkotni, és nem funkcionális (Langley és mtsai. 1975). Felfedezték, hogy a β-gal 1-59. aminosavainak (az α-peptid) transzban (külön-külön) történő pótlása lehetővé tette, hogy a csonka β-gal tetramereket képezzen és újra működőképes legyen (Ullmann és mtsai. 1967; Langley és mtsai. 1975). A β-gal megmentését az α-peptid ilyen módon történő pótlásával α-kiegészítésnek nevezték. Később Vieira és munkatársai (Vieira & Messing 1982) rájöttek, hogy az α-komplementáció felhasználható E. coli telepek szűrésére inzertek jelenlétére. Az α-peptid kódoló régióját klónozták egy pUC plazmidba, majd egy többszörös klónozási helyet (MCS) vezettek be a régió közepére. Amikor egy DNS-darabot ligáltak az MCS-be, az megszakította az α-peptidet, így a β-gal működésképtelenné vált.

Az 5-bromo-4-klór-indolil-β-D-galaktopiranozid (x-gal) a laktóz színtelen analógja. Amikor a β-galaktozidáz hidrolizálja az x-gal-t, kék terméket (5,5'-dibromo-4,4'-diklór-indigót) hoz létre. A kék-fehér szűrés során egy E. coli törzset transzformálunk egy ligációs reakcióval, és x-gal-t tartalmazó agarlemezekre terítjük. A kék színű kolónia azt jelzi, hogy a plazmidban lévő α-peptid ép (nincs inzert), míg a fehér kolónia azt jelzi, hogy az α-peptid megbomlott (inzert jelen van).

Mire lesz szüksége a kék-fehér szűréshez

  • Kompetens sejtek egy lacZΔM15 mutációval rendelkező E. coli törzsből. Common blue white compatible strains include all SIG10 (Catalog No. CMC0001), SIG10 F' (Catalog No. CMC0002), és a SIG10 5α kompetens sejtek (katalógusszám:  CMC0007).
  • A vektor az α-peptid kódoló régióval és az MCS. Gyakori kékfehér kompatibilis vektorok: pGEM-T, pBluescript, pUC18 és pUC19
  • Az Ön ligációs reakciója (azaz az Ön által választott inszert egy kékfehér kompatibilis vektorba, lásd fent).
  • Kontroll plazmid (pl. pBluescript).
  • Antibiotikum a vektor kiválasztásához.
  • X-gal 20 mg/ml. Az X-gal készen oldva vagy por alakban is megvásárolható (katalógusszám:  B4252). Feloldható DMSO  (Katalógus sz. D8418) vagy DMF (Katalógus sz. D4551) 20 mg/ml koncentrációban. Az X-gal-t -20°C-on és fénytől védve kell tárolni (fóliával körbetekerve a raktártartályt).

Hogyan készítsünk kékfehér szűrőlemezeket

  1. Készítsünk néhány LB agarlemezt a megfelelő antibiotikummal a kiválasztott plazmid szelektálásához.
  2. Minden egyes kékfehér szűréshez használandó lemezre kenjen 100 μl 20 mg/mL x-gal törzsoldatot és 100 μl 10 mM IPTG-t, és hagyja a lemezeket használat előtt kissé nyitott fedéllel megszáradni. Ez elvégezhető akár a padon lévő bunsenégő mellett, akár lamináris áramlású elszívóban. A páraelszívó használata kiszáríthatja a lemezeket, ha túl sokáig hagyja őket.

Bakteriális transzformáció

Transzformálja a ligációs reakció(ka)t kompetens E. coli sejtekbe a szokásos módon. A transzformációs reakciót terítsük ki egy x-gal IPTG lemezre (a fentiek szerint elkészítve). Inkubáljuk a lemezt egy éjszakán át 37 °C-on. Miután a telepek megnőttek, a lemezt 1 órán át 4 °C-on lehet inkubálni. Ez segíti a kék szín kialakulását, így könnyebben megkülönböztethetők a negatív kolóniák.

Egy kontrollt is célszerű beiktatni. Transzformáljunk egy aliquot E. coli-t egy ép α-peptidet tartalmazó plazmiddal (például pBluescript). Ezen a kontrolllemezen a telepeknek mind kéknek kell lenniük. Ha nem azok, akkor lehet, hogy az x-gal nem egyenletesen oszlott el, vagy az antibiotikum nem működik megfelelően.

Megjegyzés: Ez a képernyő semmilyen információt nem ad az inzert irányáról, csak a jelenlétéről vagy hiányáról. Ha az inzert meglehetősen rövid és megtartja az α-peptid keretét, lehetséges (de valószínűtlen), hogy funkcionális α-peptid fúziót hoz létre, ami kék telepeket eredményez még akkor is, ha az inzert ott van (hamis negatív eredmény). Ezek a telepek azonban valószínűleg világosabb kék színűek lesznek, mint a valódi negatívok. Az is lehetséges (de szintén valószínűtlen), hogy fehér kolóniát kapunk, ha nincs inzert (hamis pozitív). Ez abból adódhat, hogy a linearizált vektor nukleáz lebontja az α-peptidet az újraligálás előtt. Ezért mindig érdemes az inszertet szekvenálással is ellenőrizni.1,2,3

DNS-miniprep protokoll

A DNS-sel való munka képessége a baktériumokból való izolálás képességétől függ. Az elemzéshez szükséges DNS mennyisége határozza meg az alkalmazott preparálási technikát. Kis mennyiségű DNS (<5µg) esetén miniprep-et végzünk, amely általában elegendő DNS-t biztosít az elemzéshez. Ha több DNS-re van szükség, akkor maxiprep-et lehet végezni, ha pedig még több DNS-re van szükség, akkor Mega vagy Giga prep-et lehet használni.

A miniprep-et leggyakrabban annak meghatározására használják, hogy egy bakteriális klón tartalmazza-e a rekombináns DNS megfelelő darabját. Miután kolóniákat (jellemzően 5-15) szedtünk, és mindegyiket 3-5 ml LB táptalajban egy éjszakán át növesztettük, a baktériumokat pelletáljuk, majd lízingeljük. A baktériumok genomja a plazmamembrán belső felszínéhez kötődik, és mint ilyen, a kivonás során a sejt membránnal együtt marad. A kis plazmidok nem kötődnek ilyen módon, és könnyen izolálhatók a sejttörmelékből.

Sok laboratórium használ miniprep spin oszlop készleteket, mint például a GenElute™ Plasmid Mini Prep Kit (Catalog No. PLN70), vagy a GenElute Five Minute Plasmid Mini Prep Kit (katalógusszám. PFM50) szűréshez, de ez a protokoll akkor is használható, ha nem kíván kitet használni. Ez egy gyors és olcsó rutineljárás, amely meglehetősen standard vegyszerek, vízfürdő, pipetták, eppendorf csövek és mikrocentrifuga használatán alapul. Az így előállított DNS azonban valamivel gyengébb minőségű és mennyiségű lehet, mint a spin oszlop kit segítségével izolált egyenértékű DNS. Diagnosztikai klónozáshoz azonban ez nem jelenthet problémát.

DNS Miniprep Protokoll Reagensek

/h3>

Protokoll

  1. Forrás friss éjszakai folyadéktenyészetekkel (Egyetlen kolóniát szedett és beoltott 3mL LB táptalajba előző este).
  2. Adjunk körülbelül 1,5 mL-t mindegyik kultúrából egy eppendorf csőbe. Számozza meg az eppendorf-csöveket a tenyésztőcsövekre írt számoknak megfelelően.
  3. Centrifugálja a csöveket 1 percig maximális fordulatszámon, majd a felülúszót kidobva dobja el. Ügyeljen arra, hogy csak kis mennyiségű LB tápfolyadék maradjon a baktérium pelletekkel együtt.
  4. Re-szuszpendálja a pelleteket 150 µl TES-ben úgy, hogy az oldatot egy 200 µl-es pipettával fel-le pipettázza a pellet közelében (szisztematikusan haladva a pellet egyik oldaláról a másikra, amíg semmi nem marad a falhoz tapadva)
  5. /li>
  6. Gyorsan adjunk hozzá 20µL lizozimoldatot (10mg/ml desztillált vízben, általában kis készletként -20-on fagyasztva tartjuk).
  7. Inkubáljuk 5 percig szobahőmérsékleten.
  8. Pipettázzunk gyorsan 300 µL desztillált vizet a szuszpenzióhoz, a víznek el kell keverednie, miközben a csőbe permetezzük. Ne rázza fel a csöveket utána. Ezt a lehető leggyorsabban kell elvégezni, és a csöveket azonnal 73 °C-os hőblokkba helyezni.
  9. 15 percig inkubálni.
  10. 15 percig maximális fordulatszámon (13000 rpm) centrifugálni. Néha a pellet túl nagy (több pellet, mint felülúszó), ha ez így van, akkor centrifugáljunk még 15 percig, legyünk türelmesek, végül le fog pelletálódni. Ha a pellet nagy, általában a kultúra túl fiatal (12 óránál fiatalabb) volt.

    Öntse a felülúszót egy másik eppendorf-csőbe (ne felejtse el a számozást). Adjunk hozzá 5M NaClO4-et (a felülúszó térfogatának kb. 10%-át, általában 300µL 10%-át. Ha néhány csőben kevesebb felülúszó van, adjon azokhoz egy kis TE-t, hogy úgy nézzenek ki, mint a többség). Zárja le a fedeleket, és keverje össze a csöveket rázással. Ez történhet akár az állványban a fedél segítségével, hogy a csövek ne essenek ki, akár a csöveket egyenként rázva.
  11. Adjunk hozzá 400 µL izopropanolt, rázzuk össze az előzőek szerint, és centrifugáljuk 15 percig maximális fordulatszámon.
  12. Dobjuk ki a folyadékot, és centrifugáljuk még egyszer 2 percig. Távolítsa el az utolsó csepp folyadékot egy 200 µl-es pipettával.
  13. Szárítsa 15 percig 37 °C-os helyiségben vagy inkubátorban nyitott fedelekkel.
  14. Adjunk hozzá 50 µL TE-t, és tegyük rázógépre 5 percre, majd tároljuk a DNS-t, vagy folytassuk a szűrő telepek protokollját.

A legtöbb in vitro vizsgálathoz emlősök tenyészetében több DNS-re van szükség, mint amennyit a miniprep során izolálunk. Általában a helyes klón azonosítása után a DNS-t újra be lehet vinni a baktériumokba, és maxiprep protokollal lehet izolálni. Az is lehetséges, hogy a minipreppekhez használt kultúrák egy kis részét megtartjuk, majd a helyes klónt tartalmazó kultúrát egy éjszakán át tenyésztjük. Ez időt takarít meg azzal, hogy nem kell újra transzformálni a baktériumokat, és nem kell újra kolóniát választani.

Szűrés restrikciós emésztéssel

A restrikciós emésztést annak megállapítására végzik, hogy a kiválasztott klón tartalmazza-e az inszertet. Ez az emésztés minőségellenőrzésre vagy különböző klón-rekombinánsok tesztelésére szolgál, és csak kis mennyiségű plazmidot igényel, amelyet standard ideig (1 óra) kell emészteni a felesleges enzimmennyiséggel. A teljes reakciót agarózgélre kell tölteni. Nincs szükség az időfutamra, mint a preparatív emésztésnél.

200ng plazmid általában elegendő, és 1 egység enzim 10 µl teljes reakciótérfogatban. Ne feledje, hogy a nagyobb plazmidoknál előfordulhat, hogy kicsit több DNS-t kell használnia, ha kis fragmentumokat vág ki. Egy 3 kb-os plazmid 200ng-ja ötször több kópiát jelent, mint egy 15 kb-os plazmidé, és így ötször kevesebb kópia marad a kivágott fragmentumokból.

Ha a plazmid nem egy viszonylag tiszta maxiprep vagy szilikagyanta alapú miniprep kitből származik, akkor lehet, hogy több enzimet kell használnia. Ha a DNS-t az ezen a weboldalon található miniprep protokoll segítségével állítottuk elő, akkor érdemes megduplázni vagy megháromszorozni az enzim mennyiségét. A leggyakrabban használt enzimek közé tartozik EcoR I (Catalog No. R6265), BamH I (Katalógus sz. R0260), és Hind III (Katalógus sz. R1137).

Reagensek egy tiszta plazmidhoz 1 µg/µL

  • 0.2-0,5 µL plazmid
  • 1 µL 10x restrikciós puffer
  • 0.1-0,3 µL restrikciós enzim 1
  • 0,1-0-0.3 µL Restrikciós enzim 2 (opcionális)
  • Készítsen legfeljebb 10 µl-t TE (Katalógus sz. T9285) vagy nuclease free water (Catalog No. W4502)

Reagensek fenol-kloroform extrahált miniprep plazmidhoz (DNS-koncentráció sokkal alacsonyabb és általában ismeretlen)

  • 3 µl plazmid
  • 1 µl 10x restrikciós puffer
  • 0.1-0,3 µL restrikciós enzim 1
  • 0,1-0-0.3 µL Restrikciós enzim 2 (opcionális)
  • Megfelel 10 µL TE-vel vagy vízzel

Protokoll

  1. Számítsa ki a szűrendő minták teljes számát, majd adjon hozzá egyet (n+1).
  2. Készítsen mesterkeveréket a fenti irányelvek szerint a szűrendő DNS kivételével minden mással. Tehát ha tíz mintája van, használjon 11 µL 10x Restriction puffert, 1,1 µL enzimet és 95,7 µL vizet.
  3. Adjon egy aliquotot (mínusz a DNS-mennyiség) a mastermixből a minták számának megfelelő számú csőhöz. Ebben az esetben 10.
  4. Adja hozzá a DNS-t, és keverje össze a hegyével, hogy biztosan emésztődjön.
  5. Inkubáljon 1 órán át 37 °C-on
  6. Adjon hozzá 1 µL töltőfestéket, és töltse fel agarózgélre.

Megjegyzés: Egyes enzimek 37 °C feletti vagy alatti hőmérsékleten reagálnak. Ellenőrizze, mielőtt beállítja a reakciót.

Kolóniák szűrése PCR segítségével

Az agárlemezről származó kolóniák PCR-módszerrel történő szűrése lehetséges annak kimutatására, hogy mely baktériumok rendelkeznek a megfelelő rekombináns DNS-sel, anélkül, hogy egy éjszakán át kellene őket tenyészteni. Ennek egyik módszere, hogy egyszerűen megérintünk egy kolóniát egy steril hegyével, majd a hegyet rövid időre PCR-keverékbe mártjuk egy PCR-csőben, majd ugyanezt a hegyet némi táptalajba mártjuk, hogy egy éjszakán át növesszük őket. Ez általában csak akkor működik hatékonyan, ha viszonylag kis régiót kell felerősítenie (<500bp) a rekombináns plazmid kimutatásához, és az amplifikáció 98ºC-os szakaszaira támaszkodik, hogy a baktériumokat lízisbe hozza a DNS felszabadítása érdekében. Annak biztosítására, hogy a E.coli a PCR-amplifikáció elvégzése előtt hatékonyan lizálódjon, az alábbi protokoll megbízhatóbb alternatívaként használható.

  1. Készítsen 5 mg/ml proteináz K törzsoldatot 25 mg PCR minőségű Proteináz K  (katalógusszám. P2308) 5 ml T0.1E-ben (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Tárolja aliquotokban -20 ºC-on.
  2. Minden egyes mintához készítsen 25 µl lízisoldatot úgy, hogy 1 µl 5 mg/mL proteináz K törzsoldatot és 24 µl T0,1E-t összekever egy eppendorf csőben
  3. Sztérikus pipettahegy segítségével szedje ki a kolóniát.
  4. Piszkáljon néhány sejtet egy címkézett LB lemezre (megfelelő antibiotikummal).
  5. A maradék sejteket helyezze a lízisoldat 25 µl-es aliquotájába.
  6. Inkubálja a címkézett lemezt egy éjszakán át 37 ºC-on a telepek regenerálódásához.
  7. Kezdje meg a sejtlízist a minták 55 ºC-on történő 15 perces inkubálásával.
  8. Inkubálja a mintákat 80 ºC-on 15 percig.
  9. Hűtse le a mintákat jégen.
  10. Keverje össze és röviden forgassa le.
  11. Használjon fel 1 µl lizátumot egy PCR-reakcióban.

Maxipreps protokoll

Szükséges reagensek

  • TE 50/1 puffer (50mM Tris-HCL (Katalógus sz. 93362) pH 8.0, 1mM EDTA (Katalógusszám  E6758) pH 8.0)
  • Lysozim (Katalógus sz. L6876) 10mg/ml vízben.
  • 0,5M EDTA pH 8.0
  • Ribonukleáz A  (katalógus sz. R4642) 20 mg/ml oldatát desztillált vízben, és 50µl-es aliquotokban -20°C-on tároljuk.
  • 10% Triton X 100 vízben
  • Equilibrált fenol  (katalógus sz.  P4557) (pH 8,0, 0,1% 8-hidroxikinolin)
  • 5M NaClO4 (Katalógus sz. 410241)
  • Isopropanol (Katalógus sz. I9516)
  • TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 0,1 mM EDTA pH 8.0)
  • SS34 Sorvall 50ml csövek és rotor vagy hasonló
  • 30ml Corex csövek és HB4 rotor vagy hasonló

Potenciális veszély: A fenol nagyon veszélyes és érintkezéskor azonnal bőrégést okoz. Érintkezéskor, belégzéskor és fogyasztáskor is mérgező. Olvassa el és értse meg az SDS-t, mielőtt bármilyen veszélyes vegyi anyagot használ.

Megjegyzés:  Elkötelezettek vagyunk amellett, hogy olyan zöldebb alternatív termékeket kínáljunk Önnek, amelyek betartják A zöldebb kémia 12 alapelve közül egyet vagy többet. A GenElute™ Maxi Prep készleteket a biztonságosabb kémia érdekében terveztük. Kérjük, fontolja meg e készletek valamelyikének használatát a fenol-kloroformos DNS extrakciók elvégzése helyett.

Olvassa el a protokollt, mielőtt elkezdi, és győződjön meg róla, hogy minden törzsoldat készen áll. A lizozim oldatot általában a centrifugálás során készítjük el. A többinek készen kell lennie, mielőtt elkezdi.

  1. Készítsen előkultúrát 3 mL LB táptalajból, mégpedig úgy, hogy reggel első dolga leszed egyetlen kolóniát egy friss agarlemezről (ideális esetben előző este csíkozott).
  2. 3 óra elteltével az előkultúrának enyhén zavarosnak kell lennie, oltsunk be 800 ml 37 °C-ra előmelegített LB táptalajt (500-szoros hígítás) és növesszük egy éjszakán át (24 óra). Rövidebb inkubáció esetén a sejtlizátumban lévő felesleges fehérjék és RNS problémákat okozhat.
  3. Centrifugálja a kultúrát a rendelkezésre álló infrastruktúra segítségével (pl. 60 perc, 3699rpm), és óvatosan távolítsa el a felülúszót. A 250 ml-es polipropilén kúpos aljú csövek jól működnek. A felülúszó még mindig tartalmazni fogja az E.coli-t, ezért ne borítsa egyenesen a mosogatóba.
  4. Tegye a sejtpelleteket tartalmazó csöveket jégre, és szuszpendálja újra a pelleteket 8 ml jéghideg TE 50/1-ben (lásd fent). A pelleteket időnkénti vortexeléssel és a jégre való visszahelyezéssel teljesen reszuszpendálni kell, ez némi időt vesz igénybe (5 perc). A sejtszuszpenziót 10 ml-es pipettával vigyük át tiszta SS34 50 ml-es csövekbe, amelyek már jégen állnak. Minden további manipulációt jégen végezzünk! Ez egy jó pont arra, hogy szükség esetén szünetet tartson.
  5. Gyorsan adjon 2,5 mL frissen készített lizozim oldatot (10mg/ml) minden csőbe, zárja le a csöveket, és gyorsan fordítsa őket fejjel lefelé és vissza legalább 10-szer (lehetőleg az összes csövet egyszerre. A szuszpenziónak enyhén viszkózusnak kell lennie. Ne rázza a csöveket, csak forgassa őket. A rázással a genomi DNS le fog nyíródni, és ez szennyezi a plazmid DNS-t.
  6. 5 percig jégen inkubáljuk.
  7. Csavarjuk le a palackokat, és mostantól jegyezzük meg, hogy melyik kupak melyik csőhöz tartozik (nagyon fontos, mert az oldat viszkózus, és jelentős része a kupakhoz fog ragadni). Gyorsan adjunk hozzá 2,0 mL 0,5M EDTA pH 8,0-t, zárjuk le a csöveket, és fordítsuk el őket újra, mint korábban. Ismétlem, ne rázza őket erőteljesen! A szuszpenzió viszkózusabbá válik.
  8. Inkubáljon még 5 percig jégen.
  9. Keverjen össze 50µL Ribonukleáz A oldatot (lásd fent) 150µL Triton X-100 10%-os oldattal, és töltse fel 1ml-re TE 50/1. Adja ezt a keveréket a csövekbe. Ezután zárja le a csöveket, és forgassa meg őket, mint korábban (ne rázza őket). A szuszpenzió még viszkózusabb lesz.
  10. Inkubáljuk 30 percig jégen, anélkül, hogy újra megérintenénk őket. Az ötlet az, hogy a mosószer nagyon kíméletesen, jégen hagyja, hogy a sejtlízis többi részét a detergens végezze el.
  11. Centrifugáljon 18 000 rpm-en Sorvall SS34 rotorban vagy hasonlóban 60 percig. Szép pelletet kell kapnia, de néha a pellet nagy lehet, nagyon kevés felülúszóval. Ez általában akkor fordul elő, ha a baktériumkultúra túl fiatal. Ebben az esetben ismételje meg a centrifugálást, ennek segítenie kell.
  12. A tiszta felülúszót vigye át egy tiszta Falcon-csőbe. Most lehetőség van az eljárás hosszabb időre történő megszakítására, ha a visszanyert felülúszókat -20 °C-on lefagyasztja. Az is lehetséges, hogy ebédszünetet tartunk, és a felülúszót jégen tartjuk.
  13. Adjunk hozzá 20 ml ekvilibrált fenolt (lásd fentebb), és 1 percig rázzuk erőteljesen, majd 20 percig forgassuk le maximális sebességgel a kilengő rotorban.
  14. Lassan nyerjük vissza a vízfázist (felső), és ügyeljünk arra, hogy az interfázist a csőben hagyjuk. Vigye át a felső fázist egy új csőbe, és adjon hozzá 20 ml kloroformot, rázza fel ismét, mint korábban, és pörgesse le az előzőekhez hasonlóan 5 percig.
  15. Lassan nyerjük vissza a vízfázist (ezúttal könnyebb elkerülni az interfázist), helyezzük át egy 30 ml-es Corex csőbe (10 és 15 ml között, a térfogatokat TE 50/1 hozzáadásával kell kiegyenlíteni), adjunk hozzá 1mL 5M NaClO4-et (a víz térfogatának 10%-a), keverjük össze és adjunk hozzá 8mL izopropanolt (a víz térfogatának 80%-a).
  16. Zárja le a csövet parafóliával, és forgassa meg néhányszor, hogy mindent összekeverjen. Ezután pörgesse le HB4 rotorban 10 000rpm-en 15 percig.
  17. Vessük el a felülúszót, szárítsuk meg a pelletet a fedelet nyitva hagyva a padon vagy 37 °C-on.
  18. Re-szuszpendáljuk 500 µL TE-ben, és tegyük át egy steril eppendorf csőbe. Kerülje a pellet túlszárítását.
  19. Tárolja 4 °C-on.
  20. Az RNS mennyiségének értékeléséhez ellenőrizni kell a DNS-t gélen , általában ezen a ponton egy második RNáz kezelést kell végezni.

Megjegyzés: Az izolált plazmid DNS készen áll a rovar- vagy emlőssejtekbe történő transzfekcióra standard transzfekciós reagensek, például Escort™ IV (termékszám. L3287), Universal Transfection Reagent (T0956 termékszám) vagy a Calcium Phosphate Transfection Kit (CAPHOS termékszám).

DNS-csapadékolás protokoll

A DNS kicsapása nem mindig sikerül. Néha ugyanolyan mennyiséget kapunk, és annak koncentráltabb és tisztább a végeredménye, néha pedig semmit sem kapunk. Ha jól csinálod, akkor jól kell működnie, de a nagy térfogatokban alacsony DNS-koncentrációval (<20ng/μL) való munka trükkös lehet.

Anyagok

  • 3M nátrium-acetát puffer, pH 5,2 (ideális esetben 4 °C-on)
  • hideg 100%-os etanol (ideális esetben -20 °C-on) (Termék sz. 57023)
  • Hideg 70%-os etanol steril dH2O-ban (Ideális esetben -20 °C-on)
  • DNS-minta
  • Mikrocentrifuga (Ideális esetben hűtött centrifuga vagy hűtőkamrában tartott centrifuga). Centrifugáljon kikapcsolt fékkel.

Protokoll

  1. A DNS-t olyan edénybe helyezze át, ahol a teljes térfogat kevesebb mint egynegyedét foglalja el (például 1.5mL-es csőben legfeljebb 375 µL DNS-oldat lehet).
  2. Adjunk a DNS térfogatának egy tizedét nátrium-acetát puffert az ionkoncentrációk kiegyenlítéséhez.
  3. Adjunk hozzá 2-3 térfogat hideg 100%-os etanolt, és helyezzük a mintát legalább egy órára -20 °C-os fagyasztóba.
  4. Centrifugáljuk a mintát 15 percig a legnagyobb fordulatszámon (12-13000 rpm) 4 °C-os mikrocentrifugában.
  5. A felülúszóból a lehető legtöbbet távolítsuk el 1 ml-es pipettával vagy üvegkapilláris csővel. Vigyázzon, hogy ne zavarja meg a pelletet. Ha az összes folyadékot kiszedte, folytassa a 6. lépéssel. Ha nem, akkor centrifugáljon újra röviden, majd a maradékot 200 µl-es pipettával távolítsa el.
  6. Adjon hozzá 250 µl hideg 70%-os etanolt.
  7. Centrifugáljon 5 percig 4 °C-os centrifugában maximális fordulatszámon.
  8. Vegye ki a felülúszót 200 µl-es pipettával; a maradék etanolt 37 °C-os vízfürdőben párologtassa el. Ne tegye ezt túl sokáig, mert a pellet túlszárítása megnehezítheti a reszuszpendálást.
  9. Re-szuszpendálja a pelletet a kívánt mennyiségű vízben vagy TE-pufferben.

1. tipp: A kicsapás 4 °C-on történő elvégzése nem feltétlenül szükséges a működéshez, de növelheti a hatékonyságot, különösen alacsony koncentrációjú minták (<20ng/ µl) esetén.

Tipp 2: A DNS-csapadékozás a DNS-minták tisztítására is használható, nem csak koncentrálására. Ez eltávolítja az oldatból a szennyező sókat.

RNázkezelés és RNS eltávolítása

Reagensek

Potenciális veszély: A fenol nagyon veszélyes, és érintkezéskor azonnal bőrégést okoz. Érintkezéskor, belégzéskor és fogyasztáskor mérgező. Olvassa el és értse meg az SDS-t, mielőtt bármilyen veszélyes vegyi anyagot használ.

Potenciális veszély: A kloroform belélegezve, szájon át fogyasztva és bőrrel érintkezve mérgező. Olvassa el és értse meg az SDS-t, mielőtt bármilyen veszélyes vegyi anyagot használ.

  1. Hígítsa a maxiprep-et 5mL-re TE-vel egy 50mL-es Falcon csőben.
  2. Adjon hozzá 50μL RNáz A-t (20mg/mL) és inkubálja szobahőmérsékleten 30 percig.
  3. Adjunk hozzá 5mL fenolt, és rázzuk erőteljesen 1 percig, majd 15 percig forgassuk le maximális sebességgel a swing out rotorban.
  4. Lassan nyerjük vissza a vizes fázist (felső), és ügyeljünk arra, hogy az interfázist a csőben hagyjuk. Vigye át egy új csőbe, és adjon hozzá 5mL kloroformot, rázza újra, mint korábban, és pörgesse az előzőekhez hasonlóan 5 percig.
  5. Lassan nyerje vissza a vízfázist (ezúttal könnyebb elkerülni az interfázist), vigye át egy 15mL-es Corex csőbe (kb. 5mL), adjon hozzá 500μL 5M NaClO4-et (a víz térfogatának 10%-a), keverje össze, és adjon hozzá 4mL izopropanolt (a víz térfogatának 80%-a). Zárja le a csövet parafóliával, és forgassa meg néhányszor, hogy mindent összekeverjen.
  6. Ezután HB4 rotorban 10 000rpm-en 15 percig pörgesse le.
  7. Dobja el a felülúszót, szárítsa meg a pelletet, szuszpendálja újra 500 µl TE-ben (10mM Tris-HCl pH 8.0; 0,1 mM EDTA pH 8,0), és tegyük át egy steril eppendorf-csőbe.
  8. Tároljuk 4 °C-on.
  9. A DNS-t agarózgélen ellenőrizzük, hogy az RNS nagy része eltűnt-e már. Határozza meg a DNS koncentrációját és tisztaságát spektrofotometriásan (a nanodrop hasznos eszköz ezen a ponton).

Tisztítsa meg a DNS-t

Sok rekombináns DNS-eljárás reakciókörülményei nem kompatibilisek, például a restrikciós emésztés és a ligálás között. Ilyenkor el kell távolítani az előző lépésből származó enzimet és puffert, hogy a következő lépést el lehessen kezdeni. Ezt különböző módszerekkel lehet elvégezni, többek között extrakciós és tisztító készletekkel, fenol-kloroformos extrakcióval vagy miniprep-készletekkel, módosított módszerrel. Valószínűleg a legtöbb laboratórium számára a legfontosabb szempont a költség. A fenol-kloroformos extrakció a legolcsóbb, a miniprep spin oszlop használata pedig a legdrágább. A biztonság szempontjából azonban ez pont az ellenkezője!

A reakciók tisztítására számos speciális készlet létezik. Sokan használnak PCR tisztító készleteket , mint például a GenElute™ PCR Cleanup Kit (katalógusszám. NA1020) az enzimatikus reakciók tisztítására, de ellenőrizze az oszlop méretkizárási határértékeit és a kötési kapacitásokat. Egyes PCR-kitek nem kötik meg a <200bp vagy >4-5kb DNS-t.

Az alábbiakban a fenol és a kloroform használatának módszere látható a DNS enzimatikus reakcióból történő kivonásához, de a folytatás előtt olvassa el az SDS-t. A vizes felső fázis visszanyerésének lépései kicsit trükkösek, talán a legnehezebb az összes rekombináns DNS-technika közül, és érdemes hamis mintán (csak TE) begyakorolni, mielőtt belevágunk. Reszkető kezek nem segítenek.

Reagensek

  • TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)
  • Equilibrált fenol
  • Kroloform
  • 5M nátriumperklorát (5M NaClO4)

Potenciális veszélyforrás: A fenol nagyon veszélyes, és érintkezéskor azonnal bőrégést okoz. Érintkezéskor, belélegezve és elfogyasztva is mérgező. Olvassa el és értse meg az SDS-t, mielőtt bármilyen veszélyes vegyi anyagot használ.

Potenciális veszély: A kloroform belélegezve, szájon át fogyasztva és bőrrel érintkezve mérgező. Olvassa el és értse meg az SDS-t, mielőtt bármilyen veszélyes vegyi anyagot használ.

  1. Tegyen 50μL "piszkos" DNS-t egy 1,5mL-es eppendorf csőbe.
  2. Adjunk hozzá 50 μL TE-t.
  3. Adjunk hozzá 50 μL kiegyenlített fenolt.
  4. Vortexeljünk (a mintának "tejszerűvé" kell válnia). Az ötlet az, hogy emulziót kapjunk a fenol és a vízfázis között. Ügyeljen arra, hogy a fedél megfelelően zárva legyen. A fehérjék a fenol fázisba fognak vándorolni, míg a DNS a vizes fázisban marad.
  5. Adjunk hozzá 100 μL kloroformot és keverjük össze. Ügyeljen arra, hogy a fedél megfelelően zárva legyen. Most, hogy a DNS és a fehérjék felosztódtak, a cél a két fázis szétválasztása.
  6. Centrifugálja a csövet 5 percig maximális fordulatszámon (12-13000 rpm) mikrocentrifugában.
  7. Vegye vissza a felső (vizes) fázist, és helyezze át egy új 1.5 ml-es csőbe, amely 100 μL kloroformot tartalmaz.
  8. Körbeforgatjuk és ismét 2 percig maximális fordulatszámon centrifugáljuk mikrocentrifugában.
  9. A felső (vizes) fázist visszanyerjük egy új, 1 mL-es csőbe.5 ml-es csőbe, majd adjunk hozzá 10 μL 5M NaClO4-t és keverjük össze.
  10. Adjunk hozzá 110 μL izopropanolt, vortexeljünk és centrifugáljuk 15 percig maximális fordulatszámon mikrocentrifugában.
  11. Óvatosan dobja el a felülúszót, és ismét centrifugáljon 1 percig maximális fordulatszámon.
  12. Egy finom pipettahegyet vagy finom üveg pasteur pipettát helyezzen a pellet ellentétes oldalára (amelynek alig láthatónak kell lennie), és szívja ki a folyadékot. Akkor is folytassa a szívást, amikor a folyadék már eltűnt, hogy az összes folyadékot eltávolítsa a cső faláról. A pipetta mozgatásával és a kapilláris erők kihasználásával próbálja meg összegyűjteni az összes cseppet is, amelyet a cső falán lát. Fontos, hogy csak száraz pellet maradjon.
  13. A csövet 1 percig hagyja nyitva szobahőmérsékleten, majd a pelletet reszuszpendálja azt megfelelő mennyiségű TE-ben (kb. 30-50μL).
  14. Tartsa a csövet jégen és időnként vortexeljen, valóban eltart néhány percig, amíg a pelletben lévő összes plazmid újra feloldódik.
  15. Most már áttérhet a következő manipulációra, például a ligáláshoz.

Tipp: A fenolos hulladékok ártalmatlanítása sok laboratóriumban nehézkes lehet. Ideális esetben vegye fel a kapcsolatot az épületében a biztonságért és az ártalmatlanításért felelős személlyel, és kérdezze meg, mit kell tennie, hogy megfeleljen a helyi előírásoknak.

Hivatkozások

1.
Langley KE, Villarejo MR, Fowler AV, Zamenhof PJ, Zabin I. 1975. Molecular basis of beta-galactosidase alpha-complementation.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72(4):1254-1257. https://doi.org/10.1073/pnas.72.4.1254
2.
Ullmann A, Jacob F, Monod J. 1967. Characterization by in vitro complementation of a peptide corresponding to an operator-proximal segment of the ?-galactosidase structural gene of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 24(2):339-343. https://doi.org/10.1016/0022-2836(67)90341-5
3.
Vieira J, Messing J. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 19(3):259-268. https://doi.org/10.1016/0378-1119(82)90015-4
Kapcsolódó cikkek
Kapcsolódó termékkategóriák
A folytatáshoz jelentkezzen be

Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.

Még nem rendelkezik fiókkal?