Kompetens sejtek protokolljai
Bevezetés
A transzformáció olyan folyamat, amelynek során egyes baktériumok idegen genetikai anyagot (csupasz DNS-t) vesznek fel a környezetből. A citoplazmába kerülve a genetikai anyagot nukleázok lebonthatják, ha az eltér a bakteriális DNS-től. Ha az idegen genetikai anyag hasonló a bakteriális DNS-hez, akkor beépülhet a kromoszómába. Néha az exogén genetikai anyag plazmidként együtt létezhet a kromoszómális DNS-sel.
Nem minden baktérium képes exogén DNS-t felvenni a környezetéből. Ahhoz, hogy a baktérium felvegye a DNS-t, kompetensnek kell lennie. A baktériumok lehetnek természetes módon kompetensek vagy mesterséges módszerekkel kompetensekké tehetők. A természetes kompetenciát szabályozó tényezők a különböző nemzetségekben eltérőek. A kompetens sejtek megszerzésének gyakorlati megközelítése a baktériumsejtek mesterséges kompetenssé tétele vegyszerek vagy elektromos impulzusok segítségével.
- A kompetencia kémiai indukciója a következő lépésekből áll:
- a sejtek hűtése kalcium-foszfát jelenlétében (Catalog No. CAPHOS), hogy áteresztővé tegye őket
- inkubálás DNS-sel
- hősokk-kezelés 42 °C-on 60-120 másodpercig, amely hatására a DNS bejut a sejtekbe
Megjegyzés: A hősokkkezelés elviseléséhez fontos, hogy a felhasznált sejtek a növekedés log fázisában legyenek.
- Alternatív megoldásként a baktériumsejteket elektromos impulzusoknak kitéve átjárhatóvá lehet tenni, ez az eljárás elektroporációnak nevezhető.
A transzformáció jelenségét széles körben használják a molekuláris biológiában. A baktériumok gazdasejtként felhasználhatók DNS-kópiák készítésére, klónozásra, nagy mennyiségű fehérje kifejezésére, cDNS-könyvtárak létrehozására és DNS-kapcsolódási vizsgálatokban, mivel könnyen és nagy számban termeszthetők.
Katalógusunkban elérhető kompetens sejtek
Katalógusunkban számos Escherichia coli baktériumsejteket, amelyeket az egyes törzsekre specifikusan optimalizált eljárással a legmagasabb hatékonysággal kompetenssé teszünk. Válasszon 24 új kompetens sejtek közül a legkülönbözőbb alkalmazásokhoz, beleértve a fehérjeexpressziót, a rutinszerű vagy nehéz klónozást és a könyvtárak létrehozását. Számos próbaméret elérhető!
Protokollok
A transzformáció megkezdése előtt elvégzendő teendők:
- Készítsen LB agar lemezeket, és hagyja gélesedni. Ha előre kiöntött lemezeket használunk, gondoskodjunk arról, hogy a lemezek 37 °C-ra legyenek felmelegítve.
- A plazmid DNS-ben lévő antibiotikum-markertől függően keverjük be a megfelelő antibiotikumot az LB agarba.
- Ha a rekombinánsok kék/fehér szűrésére van szükség, az LB-agarba 1 mM IPTG-t, 300 µg/ml S-Gal-t vagy 40 µg/ml X-Gal-t és 500 µg/ml vasammónium-citrátot kell keverni.
- Ha elektrokompetens sejteket használunk, tegyük az elektroporációs kamrát jégre.
- Fűtsük a vízfürdőt 37 °C-ra.
- A steril SOC táptalajt melegítsük szobahőmérsékletre (vagy 20-25 °C-ra vízfürdőben).
A kémiailag kompetens sejtek felhasználásával történő transzformáció protokollja
Szükséges, de nem biztosított anyagok:
Standard transzformációs protokoll:
- Transzferálja a szükséges számú csövet a -70 °C-os fagyasztóból nedves jégre. Ha szükséges, tegyen bele egy további csövet a kontroll DNS-hez.
- Hagyja a sejteket 5 percig felolvadni. Óvatosan kopogtassa meg többször a csöveket, hogy egyenletes szuszpenziót kapjon.
- Adjon 1-50ng tisztított plazmid DNS-t közvetlenül a többi csőben lévő sejtekhez. Óvatos kopogtatással keverjük össze, és tegyük jégre.
Megjegyzés: A kontrollhoz: Adjunk 1µL (10ng) pUC19 kontroll DNS-t az egyik csőbe. Keverje össze enyhe kopogtatással, és helyezze jégre. - Inkubálja a sejteket jégen 30 percig.
- Transzferálja a sejteket 37 °C-os vízfürdőbe pontosan 45 másodpercre.
- Transzferálja a sejteket jégre 2 percre.
- Adjon SOC médiumot minden csőbe. Helyezze át a sejteket steril polipropilén csövekbe, és lazítsa meg a kupakokat, hogy megkönnyítse a tenyészetek levegőztetését.
- Inkubálja a sejteket rázó inkubátoron (225-250 rpm) 37 °C-on 1 órán keresztül.
- Pipettázzon 10-100µL-t minden egyes transzformált sejtszuszpenzióból LB agar lemezekre szelekciós antibiotikummal, és steril szórófejjel terítse szét.
- Inkubáljuk a lemezeket 37 °C-on egy éjszakán át.
- Válasszuk ki a kolóniát (kolóniákat) és tenyésztsük ki szükség szerint.
- Iszolváljuk a plazmid DNS-t minden egyes kultúrából.
- Feldolgozza a plazmid DNS-t restrikciós enzimek segítségével; válassza szét gélelektroforézissel.
- Kultiválja a kívánt klónokat.
A transzformáció protokollja elektrokompetens sejtek felhasználásával
Szükséges, de nem biztosított anyagok:
Standard transzformációs protokoll:
- Transzferálja a szükséges számú csövet a -70 °C-os fagyasztóból nedves jégre. Ha szükséges, tegyen bele egy további csövet a kontroll DNS-hez.
- Hagyja a sejteket 5 percig felolvadni. Óvatosan kopogtassa meg többször a csöveket, hogy egyenletes szuszpenziót kapjon.
- Transzferálja az SOC tápfolyadékot a tenyésztőcsövekbe, egyet-egyet minden egyes transzformációs reakcióhoz, és hagyja szobahőmérsékleten.
Megjegyzés: Az SOC tápfolyadék mennyisége a következő lépésben hozzáadandó sejtek mennyiségétől függ. A végső térfogatnak a kompetens sejtekkel és a SOC tápfolyadékkal együtt 1000µL-nek kell lennie. - Tegyen 1 mm-es standard küvettákat és steril mikrocentrifugacsöveket jégre, egyet-egyet minden egyes transzformációs reakcióhoz.
- A kompetens sejteket helyezze át hűtött mikrocentrifugacsövekbe. Használjon 40µL sejtet a 80µL-es csomagból és 50µL sejtet a 100µL-es csomagból.
- Készítsen 5-szörös hígítást a DNS-ből vagy a ligációs keverékből TE pufferben. Adja hozzá a mikrofúziós csövekhez.
Megjegyzés: A kontrollhoz: Adjunk 1µL pUC19 kontroll DNS 5-szeres hígításából 1µL-t egy csőbe. - Pipettázzuk a DNS és sejtek keverékét hűtött 1mm-es küvettába.
- Állítsuk az elektroporátort 25kV/cm térerősségre 6ms-ra és kezeljük a sejteket.
- Vegyük ki a sejteket a küvettából és adjuk hozzá a SOC médiumot tartalmazó csövekhez.
- Inkubáljuk a sejteket rázó inkubátoron (225-250rpm) 37 °C-on 1 órán keresztül.
- Pipettázzunk 10-100µL-t minden transzformált sejtszuszpenzióból LB agar lemezekre szelekciós antibiotikummal, és szórjuk szét steril szórófejjel.
- Inkubáljuk a lemezeket 37 °C-on egy éjszakán át.
- Válasszon ki egy kolóniát, és tenyéssze szükség szerint.
- Iszolválja a plazmid DNS-t minden egyes tenyészetből.
- Feldolgozza a plazmid DNS-t restrikciós enzimek segítségével, és gélelektroforézissel válassza szét.
- Kultiválja a preferált klónokat.
Fontos tippek a transzformációs folyamat optimalizálásához:
- Visszaigazolja, hogy a sejtek még mindig fagyasztva vannak, és a kézhezvételkor még mindig van szárazjég.
- A maximális transzformációs hatékonyság érdekében használjon fenoltól, etanoltól, fehérjéktől, sótól vagy detergensektől mentes, kiváló minőségű DNS-mintát. Elektrokompetens sejtek használata esetén a DNS magas sótartalma nagyfeszültségnél ívképződést eredményez, ami károsíthatja a mintát és a berendezést.
- A jó minőségű reagenseket tartalmazó ligációs reakciókban lévő DNS használható a transzformációhoz. A DNS-ligázt nem kell inaktiválni.
- A kompetens sejteket mindig tartsa jégen; kerülje el a sejtek véletlen felmelegedését.
- A sejtek egyenletes szuszpenziójának elérése érdekében óvatosan csapolja meg a csöveket. Ne keverje vortex vagy pipetta segítségével.
- A LB agar lemezeket melegítse 37 °C-ra az optimális kolónia növekedés érdekében.
- Elektroporátor beállítások az elektrokompetens sejtek felhasználásával történő transzformációhoz:
- BTX ECM 630 modell: HV üzemmód, 2,5kV, 25µF, 100Ω, 1mm-es küvetta
- BioRad Gene Pulser: 2,5kV, 25µF, 100Ω, 1mm-es küvetta
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?