pGEX vektorok
A GST-címkézett fehérjéket egy gén vagy génfragmentum beillesztésével állítják elő a 13 pGEX-vektor egyikének MCS-ébe. Az expresszió a tac promóter ellenőrzése alatt áll, amelyet a laktózanalóg izopropil β-D-tiogalaktozid (IPTG) indukál. Minden pGEX vektor belső lacIq génnel is rendelkezik. A lacIq géntermék egy represszor fehérje, amely a tac promóter operátor régiójához kötődik, megakadályozva az expressziót az IPTG általi indukcióig, így fenntartva az inzert expressziójának szoros kontrollját.
A vektorok közül kilencnek van egy kiterjesztett MCS-je, amely hat restrikciós helyet tartalmaz. A kiterjesztett MCS megkönnyíti a számos rendelkezésre álló lambda-vektor felhasználásával létrehozott könyvtárakból nyert cDNS-inzertek egyirányú klónozását. pGEX-6P-1, pGEX-6P-2 és pGEX-6P-3 mindegyik a PreScission proteáz által a GST-domén és az MCS közötti helyspecifikus hasításhoz szükséges felismerő szekvenciát kódolja. A pGEX-4T-1, pGEX-4T-2 és pGEX-4T-3 a pGEX-2T-ből származik és trombinfelismerő helyet tartalmaz. pGEX-5X-1, pGEX-5X-2 és pGEX-5X-3 a pGEX-3X származékai és Xa faktor felismerő hellyel rendelkeznek (1.1.1. táblázat).
A pGEX-2TK a többi vektortól eltérő MCS-vel rendelkezik. A pGEX-2TK-t úgy tervezték, hogy lehetővé tegye a kifejezett fehérjék kimutatását a jelölt termékek in vitro közvetlen jelölésével. Ez a vektor tartalmazza a szívizomból nyert cAMP-függő fehérje kináz katalitikus alegységének felismerő szekvenciáját. A fehérjekináz-hely a trombin felismerőhely és az MCS között helyezkedik el. Az expresszált fehérjék közvetlenül jelölhetők fehérje-kinázzal és [γ-32P]ATP-vel, és könnyen detektálhatók standard radiometriai vagy autoradiográfiás technikákkal. A pGEX-2TK a pGEX-2T származéka, és a jelölt fehérje trombinnal hasítható.
A pGEX vektorok együttesen mindhárom transzlációs leolvasási keretet biztosítják, amelyek az EcoRI restrikciós hellyel kezdődnek (1.1. ábra). A pGEX-1λT, pGEX-6P-1, pGEX-4T-1 és pGEX-5X-1 közvetlenül képes a λgt11 könyvtárakból izolált cDNS inzertek befogadására és expressziójára.
Hivatkozzon a 2. függelékre (Control regions for pGEX vectors) a pGEX-vektorok kontrollrégióinak felsorolásához. A teljes DNS-szekvenciák és a restrikciós helyek adatai a GenBank™ adatbázisban találhatók. A GenBank hozzáférési számok a 2. függelékben találhatók (Control regions for pGEX vectors).
).
1.1. ábra.A GST-vektorok térképe, amely mutatja az olvasási kereteket és a főbb jellemzőket. Mind a 13 vektorban mindhárom olvasási keretben az MCS-től lefelé stop-kódonok találhatók (a térképen nem szerepelnek). Lásd a 2. függeléket (Control regions for pGEX vectors) a 13 vektor kontroll régióival kapcsolatban.
Válassza ki a megfelelő vektort a klónozott inzert olvasási keretének megfelelően.
Megfontolja, hogy melyik proteáz és a hasítás feltételei a legmegfelelőbbek a célfehérje preparátumához.
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?