Anti-FLAG^® M2 mágneses gyöngyök

• Anti-FLAG^® M2 mágneses gyöngyök FLAG^® Tag fehérje befogása
• Mintaelőkészítés és affinitás tisztítás
/a>
• Elektroforézis és Western Blotting
• A FLAG-jelölt fúziós fehérjék eluálási technikáinak összehasonlítása
• FLAG^® Tag antitestek, kontrollfehérjék és affinitás tisztítási eszközök

Anti-FLAG^® M2 mágneses gyöngyök FLAG-hoz<^® Tag fehérje befogására

Anti-FLAG^® Az M2 mágneses gyöngyök egyszerű, gyors és kényelmes módszert biztosítanak a FLAG^® peptidszekvenciával rendelkező fúziós fehérjék kimutatására és befogására. A gyöngyök egy egérből származó, anti-FLAG^® M2 klónú monoklonális antitestből állnak, amely szuperparamágneses vassal impregnált, 4%-os agarózgyöngyökhöz kapcsolódik. Az anti-FLAG^® M2 antitest felismeri a FLAG^® oktapeptid szekvenciát (N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C) az emlős és bakteriális sejtekben expresszált fúziós fehérje N-terminális, Met-N-terminális vagy C-terminális helyein.

A fúziós fehérje eluálására anti-FLAG^® M2 mágneses gyöngyök használata esetén különböző lehetőségek állnak rendelkezésre, amelyek közé tartozik a peptid-konkurencia, az alacsony pH és az SDS-PAGE mintapuffer. Itt összehasonlítottuk a három elúciós módszert a kontroll fúziós fehérje N-terminális Met-3XFLAG^®-BAP (P7582-BAP/a>) vagy C-terminális FLAG^®-BAP (P7457) önmagában inkubált vagy A431-sejt-lizátumba kevert fehérjét.

Elválasztás 3X FLAG^® peptiddel (F4799) való versengéssel, valamint savas pH-val (2.5-3,0) biztosította a leghatékonyabb elúciós feltételeket az Anti-FLAG^® M2 mágneses gyöngyök számára. A 3X FLAG^® peptiddel történő elúció esetén a mintáknak 30 perces inkubációra volt szükségük 100-150 ng/µl FLAG peptidet tartalmazó oldattal, míg pH-elitálás esetén a mintáknak kevesebb mint 10 perces inkubációra volt szükségük 0,1 M glicin HCl pH 2,5-3,0 mellett. Azt is kimutattuk, hogy a magas pH-értékkel (8-10) történő elúció nem volt elegendő ezzel a gyöngytípussal, és hogy a glicin HCl-lel történő hosszabb inkubáció nem növeli az eluált fehérje mennyiségét. Végül összehasonlítottuk az SDS-PAGE mintapufferrel eluált mintákat is. Ez az eluálási feltétel egyszerű volt, de mivel az M2 antitestet a töltőpufferben lévő SDS jelenléte denaturálja, a gélelektroforézissel végzett elemzés az anti-FLAG^® antitest nehéz és könnyű láncainak megfelelő sávokat mutatott.

Mintaelőkészítés és affinitástisztítás

Anti-FLAG^® Az M2 mágneses gyöngyöket (M8823) alaposan reszuszpendáltuk, és 20 µl szuszpenziót (beleértve 10 µl csomagolt gyantát) aliquotáltunk több 1.5 ml-es mikrocentrifugacsövekbe. A csöveket PureProteome™ mágneses állványba (LSKMAGS08) helyeztük, és a felülúszót eltávolítottuk és kidobtuk, miután minden gyöngy a mágnesre vándorolt. A gyantát 200 µl Tris puffer sóoldat (TBS) hozzáadásával egyensúlyba hoztuk, majd a mintát inkubáltuk (1. ábra).

1. ábra. Protokoll kisléptékű immunprecipitációhoz anti-FLAG^® M2 mágneses gyöngyökkel három elúciós módszerrel.

A mintákat a C-terminális FLAG-BAP™ fúziós fehérje vagy az N-terminális FLAG-BAP™ fúziós fehérje 0,6 ng/µl végkoncentrációra történő hígításával készítettük (300 ng fehérje 500 µl mintában). A FLAG-BAP™ fúziós fehérjét ugyanilyen végső koncentrációban A431-sejt lizátumba is bejuttattuk, amelyet 1,6 ng/µL teljes fehérje lizátum koncentrációra hígítottunk. A gyöngyök szuszpenzióban és az 500 µl mintával való érintkezésben tartása érdekében a csöveket 3 órától egy éjszakán át tartó inkubálással, végről végre forgó rotor segítségével inkubáltuk. Az inkubáció után minden csövet a mágneses állványba helyeztünk, és a felülúszót eltávolítottuk, majd háromszor mostuk 500 µl TBS-szel. A fehérjék eluálását három módszerrel végeztük:

1. A 3X FLAG^® peptiddel történő kompetícióval történő eluálást szobahőmérsékleten végeztük úgy, hogy a gyöngyöket 50 µl 100 ng/µL peptidoldattal 30 percig inkubáltuk orbitális rázógép segítségével.
2. Az SDS-PAGE mintapufferrel eluált mintákhoz 20 µL 2X Laemmli mintapuffert (DTT nélkül) adtunk, és a csöveket 10 percig 95°C-on forraltuk, mielőtt gélre töltöttük volna.
3. A pH szerinti eluálást szobahőmérsékleten végeztük el úgy, hogy a gyöngyöket 5-30 percig (a kísérlettől függően) inkubáltuk 50 µL glicin HCl (pH 2,5-3,0) vagy glicin NaOH (pH 8.0 - 10) orbitális rázógép segítségével.

Az inkubációt követően minden csövet a mágneses állványba helyeztünk, és a felülúszót (eluált frakciót) tiszta mikrocentrifugacsőbe vittük. Az alacsony pH-val eluált mintákat azonnal semlegesítettük 10 µl 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl pH 8,0 oldat hozzáadásával.

Elektroforézis és Western Blotting

A mintákat 4-12%-os SDS-PAGE gélekkel választottuk szét, 30 percig 200 volton futtatva. A géleket Coomassie festéssel festettük, vagy Immobilon^®-P PVDF membránra vittük át. A transzfer után a blotokat 2%-os zsírmentes száraz tejjel (NFDM) blokkoltuk 1 órán keresztül, majd 1 órás inkubációt végeztünk anti-FLAG^® M2 antitesttel (F3165) 1:1000 arányban hígított blokkoló pufferben. A blotokat háromszor mostuk TBS-T-ben, majd 1 órán át inkubáltuk kecske anti-mouse IgG HRP-vel (AP124P) 1:50 000 arányban hígítva.

A detektáláshoz minden blotot 5 percig inkubáltunk Immobilon^® Forte Western HRP szubsztráttal, és a képet digitális képalkotó rendszerrel készítettük.

A FLAG-címkézett fúziós fehérjék eluálási technikáinak összehasonlítása

Két kontroll fúziós fehérje, N-terminális FLAG-BAP™. és C-terminális FLAG-BAP™, valamint egy N-terminális FLAG-BAP™-mal spiccelt A431-sejt lizátumot anti-FLAG^® M2 mágneses gyöngyökkel inkubáltunk, és a három különböző elúciós módszerrel eluáltuk. A 2. ábra azt mutatja, hogy a fehérjéket mindhárom módszerrel hatékonyan eluáltuk, az anti-FLAG^® M2 antitest nehéz és könnyű láncának megfelelő extra sávok láthatóak, ha SDS töltőpuffert használtunk eluensként.

2. ábra. Az anti-FLAG^® M2 mágneses gyöngyökkel alkalmazott három elúciós módszer összehasonlítása. St= kiindulási anyag; 3X=3X FLAG^® peptid, pH=2,5 glicin.

Glicin HCl (pH 2,5-3,0) és glicin NaOH (pH 8-10,6) oldatot használtunk nyolc minta elutálásához, amelyek A431 sejtlízist tartalmaztak N-terminális FLAG-BAP™ kontrollfehérjével spiccelve. Az eluált frakciókat elektroforézissel elválasztottuk és elektroblottoltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy az anti-FLAG^® M2 mágneses gyöngyök csak savas körülmények között eluálhatók (3. ábra).

3. ábra. Elúció széles pH-tartományban (2,5 és 10,6 között), összehasonlítva a 3X FLAG^® peptiddel történő elúcióval. Balra: Coomassie-festésű gél. Jobbra: Immunoblot anti-FLAG^® M2 antitesttel.

Azért, hogy demonstráljuk, hogy a pH szerinti elúció nem igényel több mint 10 perces inkubációt a gyöngyökkel, különböző mintákat különböző inkubációs időkkel vizsgáltunk 0,1 M glicin HCl pH 2,5, 2,8 és 3,0. A 4. ábra mutatja, hogy a hozam hasonló volt az inkubációs időtől függetlenül, és hasonló volt a 3X-FLAG peptiddel történő kompetíció általi elúcióhoz.

4. ábra. Az eluált frakciók összehasonlítása 5-30 perces glicinnel történő inkubáció után. Balra: Coomassie-festésű gél. Jobbra: Immunoblot anti-FLAG^® M2 antitesttel.