IgG antitestek tisztítása HiTrap^® Protein G HP oszlopokkal

A HiTrap^® Protein G HP (3.10. ábra) egy kényelmes, használatra kész, Protein G szefarózzal^® High Performance^® előrecsomagolt oszlop. Az oszlopok 1 ml-es és 5 ml-es méretben kaphatók. Az összes HiTrap^® -oszlophoz hasonlóan a HiTrap^® Protein G HP használható gyors antitest-tisztításra fecskendővel, szivattyúval vagy kromatográfiás rendszerrel. Továbbá a tisztítási kapacitás nagymértékben növelhető az oszlopok sorba kapcsolásával.

3.10. ábra. A HiTrap® Protein G HP oszlopokat antitestek tisztítására tervezték fecskendő, pumpa vagy kromatográfiás rendszer segítségével.

A 3.11. ábra az egér monoklonális IgG₁ HiTrap^® Protein G HP-n történő tisztítását mutatja. A monoklonális antitestet hibridóma sejtkultúra felülúszójából tisztítottuk.

3.11. ábra. (A) Egér monoklonális IgG1 tisztítása sejtkultúra felülúszóból HiTrap® Protein G HP 1 ml-es oszlopon. Az egér IgG1 tisztaságát (B) nem redukáló SDS-PAGE-sel, PhastSystem-en, PhastGel 10-15 (ezüsttel festett) PhastGel 10-15 használatával és (C) agaróz-gél immunodiffúzióval igazoltuk.

Mintaelőkészítés

Az általános megfontolásokat lásd a 2. fejezetben (Sótalanítás és puffercsere).

A mintát a kötőpuffer összetételéhez kell igazítani. Ez történhet a minta kötőpufferrel történő hígításával vagy HiTrap^® sótalanító, HiPrep 26/10 sótalanító vagy PD-10 sótalanító oszlopok használatával történő puffercserével, 2. fejezet (Sótalanítás és puffercsere).

A mintának teljesen szolubilizáltnak kell lennie. Közvetlenül az oszlopra töltés előtt centrifugálást vagy filtrálást javasolunk a részecskés anyag eltávolítása érdekében (0,45 µM filter).

Ne alkalmazzon zavaros oldatot az oszlopon.

Puffer előkészítése

Megkötő puffer: 0,02 M nátrium-foszfát, pH 7,0

Elúciós puffer: 0,1 M glicin-HCl, pH 2,7

Neutralizáló puffer: 1 M Tris-HCl, pH 9,0

A pufferkészítéshez használt víznek és vegyszereknek nagy tisztaságúnak kell lenniük. A puffereket felhasználás előtt 0,45 µM filteren szűrjük át.

A HiTrap^® Protein G HP 1 ml-es vagy 5 ml-es oszlopokon történő fecskendővel történő tisztításhoz a pufferek elkészíthetők az Ab Buffer Kithez mellékelt 10×-es kötő- és eluálópuffer törzsoldatokból.

Purification

1. A gyűjtőcsöveket 60-200 µl 1 M Tris-HCl, pH 9 hozzáadásával készítse elő.0-t a gyűjtendő frakció milliliterenként.

A sav-labil IgG aktivitásának megőrzése érdekében javasoljuk, hogy adjunk hozzá 60-200 µl 1 M Tris-HCl pH 9.0-t a gyűjtőcsövekbe, ami biztosítja, hogy a minta finális pH-ja megközelítőleg semleges legyen.

1. Töltse meg a fecskendőt vagy a szivattyúcsövet desztillált vízzel. Távolítsa el a dugót, és csatlakoztassa az oszlopot a fecskendőhöz (használja a mellékelt csatlakozót), a laboratóriumi szivattyúhoz vagy a kromatográfiás rendszerhez "cseppről cseppre", hogy elkerülje a levegő bejutását a rendszerbe.
2. Vegye ki az oszlop kimeneténél lévő lecsapó véget.
3. Mossa ki az etanolt 3-5 térfogatnyi desztillált vízzel az oszlopból.
4. Egyensúlyozza az oszlopot legalább 5 térfogatnyi kötőpufferrel. Az ajánlott flow-sebesség 1 ml/perc (1 ml oszlop) és 5 ml/perc (5 ml oszlop)*.
5. Az előkezelt mintát a Luer-csatlakozóhoz fizetett fecskendővel vagy az oszlopra pumpálással juttassa fel. Az optimális eredmények elérése érdekében a minta felvitele során 0,2-1 ml/perc (1 ml-es oszlop) és 0,5-5 ml/perc (5 ml-es oszlop) flúvási sebességet használjon.
6. Mosson kötőpufferrel (általában legalább 5-10 térfogatnyi oszlopot), amíg az abszorbancia el nem éri az állandó alapvonalat, vagy amíg az effluensben nem marad anyag. A mosáshoz tartson fenn 1-2 ml/perc (1 ml-es oszlop) és 5-10 ml/perc (5 ml-es oszlop) flow sebességet.

* 1 ml/perc körülbelül 30 csepp/percnek felel meg, ha fecskendőt használunk 1 ml HiTrap^® oszlophoz; 5 ml/perc körülbelül 120 csepp/percnek felel meg, ha 5 ml HiTrap^® oszlopot használunk.

A legtöbb fajból és alosztályból származó IgG közel fiziológiás pH-n és ionerősségen kötődik a G fehérjéhez. Az adott fajból származó IgG optimális kötődési körülményeihez a legfrissebb szakirodalomban tájékozódjon.

Kerülje a túlzott mosást, ha az antitest és a ligandum közötti kölcsönhatás gyenge, mivel ez csökkentheti a hozamot.

8. Elúciós pufferrel eluáljon egylépéses vagy lineáris gradiens alkalmazásával. Lépéses elúció esetén általában 5 oszloptérfogat elegendő. Lineáris gradiens elúció esetén általában 10-20 oszloptérfogat elegendő. Az elúcióhoz tartson fenn 1-2 ml/perc (1 ml-es oszlop) és 5-10 ml/perc (5 ml-es oszlop) flúziós sebességet.

A protein G szefaróz kromatográfiás közegek széles pH-tartományban kötik az IgG-t, semleges pH-n erős affinitással. Az IgG elutálásához az antitesttől függően 2,5 és 3,0 közötti pH-ra kell csökkenteni a pH-t. Ha az elúcióhoz szükséges alacsony pH miatt az antitest vagy antitestfragment biológiai aktivitása elvész, próbálja meg a Protein A Sepharose-t; az alkalmazott elúciós feltételek általában enyhébbek (3.5. táblázat).

9. Az elúció után regenerálja az oszlopot 3-5 térfogatnyi kötőpufferrel történő mosással. Az oszlop most már készen áll ugyanannak az antitestnek az újabb tisztítására.

A tisztított IgG frakciókat sótalanító oszlop segítségével sótalanítsuk és/vagy helyezzük át megfelelő pufferbe (2. fejezet, Sótalanítás és puffercsere).

A kapacitás növeléséhez csatlakoztasson több HiTrap^® Protein G HP oszlopot (1 mL vagy 5 mL)  egymás után. A HiTrap^® oszlopok fecskendővel, perisztaltikus szivattyúval vagy  folyadékkromatográfiás rendszerhez csatlakoztatva is használhatók (az ÄKTA kromatográfiás rendszerek részleteiről az 5. fejezetben olvashat).

A HiTrap^® Protein G Sepharose HP oszlopok újrafelhasználása a minta jellegétől függ, és csak azonos minták feldolgozása esetén szabad figyelembe venni a keresztkontamináció elkerülése érdekében.

Tárolás

Tárolás előtt javasoljuk, hogy az oszlopot 5 térfogatnyi 20%-os etanollal mossa át az oszlopot a mikrobák szaporodásának megakadályozása érdekében. Tárolja az oszlopot 20%-os etanolban 2 °C és 8 °C között.