Címke eltávolító proteázok a rekombináns fehérjék tisztításához
A megbízható és robusztus fehérjetisztítási módszer számos szempontot foglal magában, beleértve a megfelelő kromatográfiás oszlopok kiválasztását, az optimális kötési és elúciós feltételek kalibrálását, valamint a tisztítási lépések sorrendjét. A rekombináns fehérjék expressziója általánosan használt lehetőség, amikor nagy mennyiségű tiszta fehérjét szeretnénk. A rekombináns fehérjeexpresszió egyik előnye, hogy a fehérjét kódoló gént módosítani lehet a fehérje oldhatóságának növelése és az oszlopos tisztítási módszerekkel történő tisztítás megkönnyítése érdekében. A gyakran módosított szekvenciák vagy címkék közé tartozik a 6xHIS-tag és a FLAG®-tag, vagy a GST, MBP és SUMO domének hozzáadása. A biotin és biotinilált anyagok hozzáadását a kívánt fehérjéhez szintén gyakran alkalmazzák, mivel a sztreptavidin oszlophoz való erős, nem kovalens kötődése miatt alkalmas választás a nagy tisztaságú fehérjék kinyerésére. Fedezze fel ajánlott biotin fehérjetisztító reagensek kínálatát az alábbi termékválasztó táblázatban.
Biotinilált proteázok oszlopon történő hasítófehérje-tisztításhoz
Néha a tisztítócímkét vagy a hordozófehérjét el kell távolítani, mivel az zavarhatja a tisztított fehérje aktivitását. Továbbá, a különböző iparágak szigorú szabályozási irányelveket követnek, amelyek gyakran tag-mentes fehérjéket követelnek meg, és a tag eltávolítása szükséges lehet a downstream tisztításhoz. A tisztítás során a címke és a fehérje proteolitikus szétválasztásának megkönnyítése érdekében a tisztító címke vagy a hordozó domén és a fehérje közé gyakran több proteáz felismerő szekvencia egyikét vezetik be (1. ábra).
Fontos, hogy ezeknek a címke-eltávolító proteázoknak specifikusnak kell lenniük, és olyan felismerő szekvenciával kell rendelkezniük, amely nem véletlenszerűen jelenik meg a fehérjében. A leggyakrabban használt proteázok közé tartozik a TEV, a HRV-3C, a trombin és a SUMO (1. táblázat). A SUMO-proteáz abban különbözik, hogy nem egy kis felismerő szekvenciát, hanem a tényleges SUMO-domén másodlagos szerkezetét ismeri fel, és a teljes SUMO-domént hasítja anélkül, hogy további aminosavakat hagyna az érdeklődő fehérjén. Ennek eredményeként a SUMO-proteáz általában a legjobb megoldás, ha autentikus N-terminális szekvenciára van szükség.
1. ábra.Példa a fúziós fehérje tisztítási stratégiájára, amely proteázt használ a tag eltávolítására a kívánt fehérjéből, majd ezt követően SDS-PAGE analízisre.
A fehérjetisztítási munkafolyamatok, amelyek magukban foglalják a címkék eltávolítását, gyakran megkövetelik, hogy a címkézett fehérjét először eluálják az affinitásgyantából. A tag eltávolításának megkönnyítése érdekében proteázt adnak a tag lehasításához, és egy további tisztítási lépést hajtanak végre az eltávolított tag és a maradék proteáz elválasztása érdekében az érdeklődésre számot tartó fehérjétől. Egy alternatív stratégia az, hogy a fúziós címkéről a fúziós címkét lehasítják, miközben az az affinitási oszlophoz van kötve. Ez a stratégia előnyös, mivel javítja az eluált fehérje tisztasági szintjét, kiküszöböli a további lépések szükségességét, és rugalmasságot biztosít az eluálópuffer összetételében. Ez a stratégia azonban kihívást jelenthet, mivel a tag-eltávolító proteáz ugyanazt a tisztítási taget viseli, mint a kívánt fehérje, ami azt eredményezi, hogy a tag-eltávolító proteáz az affinitásgyantához kötődik, ami sztérikusan korlátozza proteolitikus aktivitását.
Biotinfehérje-tisztítás
Megoldást nyújtva a korábban említett, korlátozott proteolitikus aktivitással járó kihívásra, mostantól a legnépszerűbb tag-eltávolító proteázok változatait kínáljuk. Proteázaink nem tartalmaznak gyakori tisztítási címkéket, beleértve a His-tag, FLAG®-tag reagenseket, GST & MBP-t, így ezek a proteázok nem kötődnek semmilyen gyakori affinitástisztító gyantához, lehetővé téve a maximális tag-eltávolítási aktivitást. Mivel a hozzáadott proteáz tipikus mennyisége az eluált fehérje kevesebb mint 1%-a, előfordulhat, hogy egyáltalán nem szükséges a tag-eltávolító proteáz eltávolítása. Számos proteázunk azonban biotiniilált is, ha a tag eltávolítására van szükség, ami lehetővé teszi a proteáz gyors és egyszerű eltávolítását bármilyen Avidin vagy Streptavidin gyanta használatával (2. ábra és 1. táblázat).
2. ábra.Az oszlopon történő tag-eltávolítási eljárás kiküszöböli a legtöbb szennyeződést, amely együtt kötődik az affinitásgyantához, beleértve a Ni-chelátáló oszlopokon lévő fémkötő fehérjéket is, és kíméletesebb elúciós feltételeket tesz lehetővé az elúciós puffer összetételének rugalmasabbá tételével.
Az alábbiakban bemutatott mintaadatok bizonyítják a tisztaság javulását a tag-eltávolító proteáz elúciós módszerek alkalmazásakor (3. és 4. ábra). A példában szereplő His-taggal jelölt fehérjét vagy imidazol használatával eluáltuk, vagy oszlopon belüli hasítással, HRV-3C proteázzal, biotin-taggal. Amint az SDS-PAGE analízisben látható, az oszlopon történő elúció nagyobb tisztaságú végső fehérjét eredményez, kevesebb szennyeződés látható a gélen.
3. ábra.A célfehérje tisztításának SDS-PAGE-elemzése oszlopon történő fehérjebontással. 1. sáv: Biotin-jelölt HRV-3C proteázzal (kat. sz. SAE0110) végzett oszlopon történő hasítással eluált tisztított célfehérje, 2. sáv: imidazol (kat. sz. I202) segítségével tisztított célfehérje.
4. ábra.A biotin-jelöléssel ellátott trombin-proteáz (kat. sz. SAE0147) biotiniláltsági foka, géleltolódásvizsgálattal elemezve. 1. sáv: Géleltolódás sztreptavidinnel, 2. sáv: Streptavidin nélkül.
A további biotinnal jelölt fehérjék tisztítására vonatkozó útmutatókért kérjük, tekintse meg Purification or Removal of Biotin and Biotinylated Substances és Biotin és biotinilált biomolekulák tisztítása vagy eltávolítása mágneses gyöngyökkel című forrásoldalainkat.
Ehatékonyan eltávolítja a biotinilált fehérjéket
Fontos, hogy a biotinilálás mértéke elég magas legyen a biotin-proteáz hatékony eltávolításához. A nem biotinilált proteáz nem kötődik a sztreptavidinhez, és így nem távolítható el a végső tiszta fehérjekészítményből. A biotinnal jelölt proteázok katalógusban szereplő termékeink minden egyes tételét teszteljük a biotiniiláltsági fok tekintetében, hogy meggyőződjünk arról, hogy az ≥90%-os. Ez a minőségi ellenőrzés biztosítja, hogy a proteáz a sztreptavidin hozzáadása után hatékonyan eltávolítható legyen.
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?