PCR/qPCR/dPCR próbák tervezése
A Technical Guide to PCR Technologies
A teljes PCR-munkafolyamat ki van téve olyan tényezőknek, amelyek variabilitást eredményeznek. A változó összetevők közül sok elkerülhetetlen, mint például a minta forrása vagy a reverz transzkripciós lépés szükségessége. A próbatervezés is nagymértékben változó, és ez jelentheti a különbséget a PCR sikere és sikertelensége között, valamint hozzájárul a próba reprodukálhatóságához és érzékenységéhez. A próbatervezés folyamata logikusan követi a folyamatot: Az első lépés a kívánt célpont helyének meghatározása. Bizonyos esetekben az oligók szekvenciáját az alkalmazás határozza meg, és nem kerülhető meg, pl. SNP-k kimutatása, más esetekben a teljes gén használható, pl. a kópiaszám meghatározása. A közelítő vizsgálati helyek kiválasztása után a legmegfelelőbb primerek azonosítása és a módosítások meghatározása következik. Ha a vizsgálatokat multiplexben kell lefuttatni, fontos figyelembe venni a reakcióban lévő összes oligó kölcsönhatásának lehetőségét, valamint a célpontok relatív gyakoriságát. Kihívást jelentő helyzetekben, pl. amikor a cél nagyon alacsony kópiaszámok vagy a célpontok koncentrációjának kis különbségeinek kimutatása, célszerű több primerkombinációt kiválasztani és tesztelni, majd egy megfelelő szondával kombinálni.
Az assay-tervezés folyamatát nagyban megkönnyíti a megfelelő tervezőszoftver elfogadása. OligoArchitect két lehetőséget biztosít a tervezés támogatására. Az első az OligoArchitect Online, egy szoftveres tervezőeszköz, amely számos lehetőséggel rendelkezik. Ha a tervezés speciális képességeket igényel, a második lehetőség az OligoArchitect Consultative segítségével történő tervezés igénylése, szakértő molekuláris biológusaink segítségét igénybe véve.
Amplicon kiválasztása/span>
Az amplikon a célszekvencia elemzendő régiója, amelyet az előre és a hátrafelé irányuló PCR-primerek átfognak. Az amplikon méretének meghatározása részben az elemzéshez használt módszertől függ. A PCR-fragmentumok gélelektroforézissel történő vizualizálásakor a PCR-fragmentumnak elég nagynak kell lennie ahhoz, hogy DNS-kötő festékkel hatékonyan megfesthető legyen, és a választott mesterséges méretjelölő tartományába illeszkedjen. Hasonlóképpen, amikor a fragmentumot kapilláris elektroforézis eszközön keresztül oldjuk fel, a PCR-termék 100 bázispár és bárhol 2 kb felett lesz (esetleg az enzim teljesítménye korlátozza).
A végső kiolvasáshoz qPCR alkalmazásakor kisebb amplikont választunk, hogy minden ciklusban pontos mennyiségi meghatározást biztosítsunk. Ideális esetben a qPCR-amplikon mérete 75 és 200 bázis között mozog, kivéve, ha a tervezési korlátozások miatt a primerek ezen a tartományon kívülre kerülnek. A valóságban a fragmensméretet több tényező figyelembevételével lehet meghatározni, beleértve a vizsgált biológiát is.
A vizsgálat helyét a kísérlet célkitűzései előre meghatározhatják: Ideális esetben az mRNS-célpont jelenlétének vagy mennyiségének meghatározására szolgáló próbák egy exon-exon-összeköttetés fölött helyezkednek el, hogy elkerüljék a szennyező gDNS-szekvenciák kimutatását. Ezek a régiók azonban gyakran erősen hajtogatottak; ezért pragmatikus döntést kell hozni arról, hogy az exonokon átívelő, potenciálisan rosszabb teljesítményt nyújtó vagy a jobb minőségű exonon átívelő vizsgálatot részesítsük-e előnyben. Ha az mRNS bőséges, és egy egykopíros génből íródik át, a gDNS-szennyezésből származó jel hozzájárulása lényegesen kisebb lesz, mint egy többkopíros génből származó, alacsony bőségű transzkript kimutatásakor. Az SNP-k kimutatása megköveteli a szonda vagy a primer 3' szakaszának elhelyezését a hibás illeszkedési hely fölött.
A splice-változatok elemzése a célnak megfelelő tervezési megközelítést igényel. Bizonyos esetekben kívánatos az összes splice-variáns egyidejű kimutatása, és ez egyszerűen egy olyan exonhatár kiválasztásával érhető el, amely konzervált az összes variáns között. Az egyes splice-változatok eltérő expressziójának vizsgálata azonban kreatívabb megközelítést igényel. Egy példakísérletben a cél annak vizsgálata, hogy a 6.1. ábra ábrán látható alternatív transzkriptek közül melyik fejeződik ki. Mivel az exonok viszonylag kicsik, az összes exonon keresztül történő amplifikáció körülbelül 300 bázisú terméket eredményez, a splice-variánsok amplifikációjából kisebb termékek keletkeznek. A vizsgálat tervezési lehetőségei a következők lennének:
- Tervezzen több próbát minden egyes exon-összeköttetésen, és minden mintát minden próbával szondázzon meg.
- Tervezzen egy primert az 1. exon 3' és a 4. exon 5' szakaszára. Az exonok bármely kombinációjából álló bármely transzkript amplitációja egy meghatározott hosszúságú amplikont eredményezne. A transzkript meghatározását qPCR, a reakció utáni SYBR Green I festék olvadási görbe segítségével határoznánk meg.
6.1. ábra.Egy gén négy lehetséges splice-változatban kifejeződő gén sematikus ábrázolása. Az egyes splice-változatok megkülönböztethetők specifikus primerpárok tervezésével az egyes exonok találkozásánál, vagy egy általános primerpárból történő amplifikációval az 1. és 4. exonban, és a splice-változatok megkülönböztetése qPCR, SYBR Green I festékkel végzett olvadáselemzéssel.
Az amplikonszekvenciákat általában a következő kritériumok alapján kell értékelni:
- A célszekvencia régiójának kezdeti értékelése ajánlott.
- Győződjön meg arról, hogy nincsenek-e váratlan SNP-k. A primer és a templát közötti egyetlen hibás illeszkedés akár 10 °C-kal is csökkentheti az olvadási hőmérsékletet, ami hatással lehet a PCR hatékonyságára.
- Győződjön meg arról, hogy a kiválasztott szekvencia nem rendelkezik homológiával a célfaj genomjában/transzkriptomjában található más szekvenciával. Többszervezetes rendszerek célba vételekor, pl, kórokozók kimutatása, a homológia meghatározásának ki kell terjednie az összes olyan szekvenciára, amely a mintában előfordulhat.
- Tesztelje a célszekvencia másodlagos struktúra felvételének lehetőségét az OligoArchitect, a kiválasztott tervezőszoftver vagy az mfold (http://mfold.rna.albany.edu/) hajtogatási algoritmusának segítségével, hogy modellezze a templát hajtogatását a kívánt primer lágyulási hőmérsékleten. Válassza ki azokat a sablonterületeket, amelyeknek előre jelzett nyitott szerkezete van, elkerülve a nagyon negatív ΔG értékű szárhurok-szekunder szerkezeteket. Ez fontos szempont, ha egylépéses reverz transzkripciós protokollt és génspecifikus primereket használunk.
- Kerülje a palindromikus szekvenciákat és a repetitív régiókat.
- Kerülje a G/C-gazdag területeket, törekedjen a körülbelül 50%-os GC-tartalomra.
- Multiplex próbák tervezésekor az amplikonoknak a lehető leghasonlóbbnak kell lenniük, hosszuk és CG-tartalmuk tekintetében, hogy elkerülhető legyen a torzított amplifikáció.
- A homológia vagy heterogenitás régióinak azonosítása (szükség szerint), amikor géncsaládokhoz tervezünk próbákat. A szekvenciákat ezután igazítani kell, és meg kell vizsgálni a megfelelő konszenzusos szekvencia szakaszait.
- A transzkriptspecifikus tervezéseknél (a gDNS-templátumok kimutatásának elkerülése érdekében) lehetőség szerint célozza meg az exon-exon-összeköttetés feletti régiókat.
Transzkript-specifikus amplikonszelekció
A legtöbb, de nem az összes DNS-t eltávolítjuk a mintából az RNS-tisztítás során. Az RT-qPCR során történő DNS-amplifikáció elkerülése érdekében célszerű olyan primereket választani, amelyek vagy egy olyan nagy intront flankálnak, amely nincs jelen az mRNS-szekvenciában, vagy egy exon-exon-összeköttetést fednek le (6.2. ábra).
Az EnsemblGenomes weboldalon (http://ensemblgenomes.org/) számos gerinces, baktérium, protista, gomba, növényi és gerinctelen metazoafaj ismert génjeinek intron/exon annotációi elérhetők. Alternatív megoldásként, ha a célgén genomi és cDNS-szekvenciái is nyilvánosan elérhetők, az intronok helyét a cDNS-szekvenciával a célszervezet genomi adatbázisával végzett BLAST-kereséssel lehet azonosítani (6.3. ábra). Az 6.3. ábra 1. intron elég hosszú (~6,5 kb) ahhoz, hogy a DNS-t hagyományos qPCR körülmények között vagy ellenőrzött PCR körülmények között ne lehessen felszaporítani. Az összes többi intron azonban viszonylag rövid (<1 kb), így a DNS valószínűleg felszaporodik RT-qPCR során (példa Assay optimization and validation). A primereknek vagy az exon-exon csomópontokat kell lefedniük, vagy egy hosszú (több kb) intront, vagy több kis intront kell flankálniuk.
6.2. ábra.Az (A) intron-áthidaló és (B) intron-flankáló primerek ábrázolása RT-PCR-hez. Az intronok piros színnel, az exonok zölddel vannak jelölve. A P1 és P2 primerek egy intront fednek le, a P3 és P4 primerek pedig egy intront flankálnak. Megjegyzendő, hogy a P1 és P2 primerek csak akkor hoznak létre PCR terméket a DNS-ből, ha a lágyulási hőmérséklet rendkívül alacsony. A P3 és P4 hosszabb PCR-terméket hozhat létre a DNS-ből, ha az intron rövid (~1 kb), de nem, ha elég hosszú (több kb).
6.3. ábra.A cDNS-szekvencia BLAST-illesztése a genomi DNS-szekvenciával. A Genbankból származó patkány p53 teljes cDNS-szekvenciáját (hozzáférési szám: NM_030989) használtuk a patkány genomban található azonos szekvenciák megaBLAST kereséséhez (blastn). A cDNS igazítása a 10. kromoszómán található gDNS-hez látható. Ezen információ felhasználásával a cDNS exonjai igazíthatók a megfelelő gDNS-régiókhoz, és a primerek tervezése olyan exonokra irányul, amelyeket hosszú intronok választanak el egymástól, pl. az 1. és 2. exonra.
Metiláció-specifikus vizsgálatok
A DNS-metiláció a sejtdifferenciálódás alapvető része, amely a génexpresszió stabil megváltozását okozza. A metiláció fontos a magasabb rendű szervezetek normális fejlődéséhez, és öröklődhet. A DNS-metiláción keresztül történő génszabályozás során a citozin-pirimidin gyűrű 5. pozíciójához vagy az adenin-purin gyűrű 6. nitrogénjéhez metilcsoportot adódik. A felnőtt szomatikus szövetekben a DNS-metiláció jellemzően CpG-dinukleotid kontextusban történik, míg az embrionális őssejtekben a nem-CpG-metiláció az uralkodó. A metiláció-specifikus vizsgálatokhoz a szekvencián belüli CpG-szigeteket kell azonosítani, gyakran a gén promóter régiójában. Ez az információ a Beacon Designer (Premier Biosoft) használatakor automatikusan megtalálható, és elérhető a http://www.mybioinfo.info/index.php">http://www.mybioinfo.info/index.php címen.
Primer tervezése
Bár az ebben a fejezetben ismertetett általános primer- és szondatervezési javaslatok számos alkalmazásban alkalmazhatóak, beleértve a génexpressziós vizsgálatokat, az SNP-k kimutatását, a metiláció kimutatására irányuló vizsgálatokat, a kópiaszám meghatározását, a vírusterhelés monitorozását és a splice-variánsok mennyiségi meghatározását, minden alkalmazásnak vannak specifikus tervezési megfontolásai is, amelyeket külön tárgyalunk.
A primerek általános tervezési kritériumai
A legtöbb alkalmazás esetében a primereket úgy tervezik, hogy teljesen komplementárisak legyenek a templát DNS-szekvenciákkal, amelyeket primerként használnak. A PCR-primerek alapvető tervezési szempontjai a következők:
- A primerek hossza általában 20-24 nukleotid, olvadási hőmérséklete (Tm) körülbelül 60 °C
(59±2 °C) qPCR esetén, de hagyományos PCR esetén változhat (55±5 °C). Speciális alkalmazások megkövetelhetik a primer hosszának és a Tm-nak a módosítását.
- A primerpároknak 40-60% GC-tartalommal kell rendelkezniük, és nélkülözniük kell a jelentős másodlagos szerkezetet.
- A primereknek nem szabad komplementereknek lenniük önmagukkal vagy a partner primerekkel, különösen a 3' végén. Ez csökkenti a primer-dimer termékek kialakulásának lehetőségét az amplifikáció során.
- Kerülje a 3' clamping-et (vizsgálja meg a 3' 5 bázisát, és ezek közül 3-t fogadjon el A vagy T, 2-t pedig G vagy C bázisként).
- Kerülje az azonos nukleotidból álló, 4 ismétlésnél hosszabb futásokat vagy palindromikus régiókat.
SNP-specifikus primerek
Bizonyos esetekben, például az egynukleotid-polimorfizmus (SNP) próbák tervezésekor nincs rugalmasság a próba helyét illetően, és a környező szekvencia is befolyásolja a kiválasztott oligók szekvenciáját. A klinikai állapotok és mind a csíravonalbeli, mind a szerzett szomatikus SNP-k közötti összefüggés felismerése továbbra is jelentős erőfeszítéseket tesz az egyre érzékenyebb és specifikusabb kimutatási rendszerek kifejlesztésére. Ez tükrözi az oligohibridizációval történő SNP-diszkrimináció kihívást jelentő jellegét. A kihívás a különböző mismatchek közötti destabilizációs különbségekből adódik. Míg a G:A, C:T és T:T erős destabilizáló hatással bírhat, a G:T és C:A sokkal gyengébb, mivel hidrogénkötések alakulhatnak ki, és ezért nehéz megkülönböztetni ezeket a párosításokat a természetes G:C és T:A pároktól. Számos rendszer az Amplification-Refractory Mutation System (ARMS)1 adaptációja, amelyet széles körben használtak, és amely meghatározó szerepet játszott a cisztás fibrózis mutációinak szűrésében2. Az ARMS-primerek 30 bázis hosszúak (hosszabb, akár 60 bázisú primerek is működőképesek). A 3' bázis SNP-specifikus, tehát specifikus a célszekvenciára (normál vagy mutáns bázis). Az utolsó előtti pozícióba egy további hibás illeszkedést viszünk be. Ezt a szomszédos bázisok és az SNP-eltérés figyelembevételével határozzuk meg (6.1. táblázat adaptálva Little, 2001-ből).
A Current Protocols in Human Genetics engedélyével nyomtatva. Little, S. 2001. Amplifikációs-refrakteriális mutációs rendszer (ARMS) pontmutációk elemzése. Curr. Protoc. Hum. Genet. 7:9.8.1-9.8.12.
Más kutatócsoportok hasonló ötleteket alkalmaztak, és kimutatták az N-2 és N-3 pozíciókban lévő mismatchek bevezetésének hasznosságát a primerekben, Liu et al.3 mélyreható elemzést végeztek a mismatchek relatív pozícióiról a legnagyobb destabilizációs hatás és ezáltal a legnagyobb specificitás érdekében.
Multiplex PCR
A multiplex PCR-ben több célpont egyidejű amplifikációjára van szükség, ha a csövenként több PCR-rel kívánjuk növelni az áteresztőképességet, vagy ha mintaanyagot szeretnénk megtakarítani. A sikeres multiplex PCR szempontjából a primertervezés a legkritikusabb tényező. Alapvető fontosságú, hogy az általános irányelveket kövessük, és ellenőrizzük a reakcióban felhasználandó összes primer (és szonda) kompatibilitását. Bizonyos esetekben előnyös lehet kissé hosszabb primereket használni, amelyek Tm értéke 65 °C körül van. Ha a kapott amplikonokat méretdiszkrimináció alapján kívánjuk elemezni, az analízis felbontóképességét figyelembe kell venni az assay tervezése során. Ha qPCR segítségével több célpontot próbálunk meg számszerűsíteni, az amplikonoknak a lehető leghasonlóbbnak kell lenniük az amplifikációs torzítás elkerülése érdekében. A primerek mellett fontos, hogy a templát ne tudjon stabil másodlagos szerkezetet felvenni, mivel ez akadályozná a PCR-t. Ha ismert, hogy a célpontok jelentősen eltérő koncentrációban vannak jelen, előnyös lehet egy blokkoló primer beillesztése a magas koncentrációjú célponthoz, hogy megkönnyítse az alacsonyabb koncentrációjú célpont pontos kimutatását4.
Nem kódoló RNS mennyiségi meghatározása
A kódoló genommal ellentétben a becslések szerint az emberi transzkriptom ~97%-át nem kódoló RNS (ncRNS)5;6,7 alkotja. E család egyik tagja a hosszú nem kódoló RNS, amelyet a szabályozó RNS-molekulák osztályaként írtak le. Ezek a molekulák szerepet játszanak az epigenetikában, a fejlődésben, a rákban és alapvető biológiai folyamatokban8,9. A hosszú ncRNS-eket hagyományosan úgy határozzák meg, hogy legalább 200 bázisból álló RNS-szálakból állnak10,11,12. Ez azt jelenti, hogy az amplikonhossz felismerése után a már említetteken kívül más különleges megfontolásokat nem kell alkalmazni az ilyen célpontok tervezésekor.
A mikroRNS-eket (miRNS-ek) alkotó családtagok ezzel szemben jelentős tervezési kihívásokat jelentenek. Ezek rövid, 21-23 nt hosszúságú, nem kódoló RNS-ek (sncRNS), amelyek a transzkript-feldolgozás több szakaszában, összetett sejtes útvonalon keresztül keletkeznek. A mikroRNS-ek a transzkripthez kötődve negatívan szabályozzák a fehérje transzlációt (áttekintve: Kato és mtsai., 200813), és az RNS indukált csendesítő komplex (RISC)14 kialakulását indukálják. Az olyan kereskedelmi tesztek, mint a MystiCq® vonal üdvözlendő megoldást jelentenek a miRNS által támasztott tervezési kihívásokra. A miRNS-analízishez használt qPCR-re vonatkozóan több sémajavaslat is született15 és azok számára, akik olyan szervezeteket vizsgálnak, amelyekre nincsenek kereskedelmi termékek, több publikáció is ismerteti a lehetséges megoldásokat. Ezek közül sok az eredeti miRNS-hez bázisok hozzáadásán alapul egy adapter ligálásával (22. fejezet, Casoldi, et al., in PCR Technologies; Current Innovations ed Nolan16) vagy poli-A farok hozzáadásával poliA polimeráz (PAP)17 segítségével. A tag hozzáadása az egyes miRNS-specifikus primerekhez lehetővé teszi a hibridizációs Tm optimalizálását, és a DNS-primereket tartalmazó reakciók bizonyítottan hatékonyabbak, mint a zárolt nukleinsavval18 megspékeltek. Ebben a jelentésben a miRNS-re specifikus DNS-primereket a hagyományos PCR-primer-irányelvek alapján terveztük, további megfontolásokkal:
- Vizsgáljuk meg a miRNS-szekvenciát, és hagyjuk figyelmen kívül a 3' terminális A-bázisokat. - Az előre irányuló primert az 5'-től a 3' terminális 4 bázisáig tartó szekvencia leghosszabb szakaszaként határozzuk meg (a fent azonosított A-bázisok figyelmen kívül hagyásával).
- Előnyösebb, ha a forward primer 3' szakaszán lévő 2 bázis közül az egyik A vagy T.
- Előnyösebb, ha a 3' szakasz 3 bázisa 1 vagy 2 A vagy T bázist tartalmaz.
- A 3' 5 bázis között lehetőleg 2-3 A vagy T szerepeljen.
- Az előprimer Tm -jének elemzése a legközelebbi szomszéd algoritmus segítségével. Ha ez 59 °C alatt van, adjuk hozzá a következő bázisokat az 5'-hez a megadott sorrendben, és minden egyes hozzáadás után számítsuk ki a Tm -t: G,A,C,G,C (ami a CGCAGN18 formájú primert eredményezi, ahol N a miRNS-specifikus bázisok). Válasszuk ki a legrövidebb primert, amelynek Tm értéke a legközelebb van az 59 °C-hoz. Ha 59 °C felett van, távolítsuk el az 5' bázisokat, és minden egyes bázis eltávolítása után számítsuk ki a Tm -t. Válassza ki a leghosszabb primert, amelynek Tm Tm értéke a legközelebb van az 59 °C-hoz.
- Válassza ki a fordított primer 3' bázisait, ügyelve arra, hogy ezek ne legyenek komplementerek az előre irányuló primerhez. Értékelje a terminális 5 bázist a forward primer esetében leírtak szerint.
- Adjunk 15×T-t a primerhez (pl, 5' T15 N5 3').
- Az előprimer Tm -jét a legközelebbi szomszéd algoritmus segítségével elemezze. Ha ez 59 °C alatt van, adjuk hozzá a következő bázisokat a primer 5'-éhez a megadott sorrendben, és minden egyes hozzáadás után számítsuk ki a Tm -t: G,A,C,C,C, T,G,G,A,C,C, C (ami egy CAGGTCCAG T15 N5 formájú primert eredményez, ahol N a miRNS-specifikus bázisok). Válasszuk ki a legrövidebb primert, amelynek Tm értéke a legközelebb van az 59 °C-hoz.
- A RT-primer a CAGCTCCAG T15 V N (ahol V=A, C és G és N=A,C,G,T).
Primer tervezési példa
Mivel a célszekvenciák diktálják a primer szekvenciákat, nem mindig lehetséges a kívánt tervezési kritériumok elérése. Ezért az assay-tervezéssel kapcsolatos kompromisszumokat az assay-specifikus optimalizálással lehet áthidalni. Egyes PCR-célpontok speciális feldolgozást igényelhetnek a sikeres assay megtervezése előtt. Gyakran előforduló eset a kórokozók, köztük vírusok kimutatása. Jól ismert, hogy sok vírus nagyfokú variabilitással rendelkezik a genomjuk bizonyos helyein. Jó példa erre a hepatitis B vírus. Egy nemrégiben végzett tanulmányban az ismert HBV-variánsok19 elleni sikeres qPCR-teszt megtervezéséhez az összes rendelkezésre álló HBV genomiális szekvencia kiterjedt összehangolására volt szükség. Több száz szekvenciát hasonlítottak össze a ClustalW segítségével, hogy megtalálják a konszenzusos szekvencia jelentős szakaszait, amelyek felhasználhatók egy általános próbatervezéshez. Az összehangolás eredményének egy részletét a 6.4. ábra mutatja be. A csillagok (*) az összes genom elemzése során talált konszenzus nukleotidokat jelölik (számos más szekvencia, amely része volt ennek az összehangolásnak, a helyhiány miatt nem látható).
6.4. ábra.A HBV genom adatainak részleges ClustalW-elemzése. Az összes ismert HBV genomi szekvenciát a ClustalW segítségével illesztettük egymáshoz, és konzervált nukleotidokat azonosítottunk (*).
A primerek és szondák tervezésekor ilyen helyzetekben szükség lehet olyan oligók használatára, amelyek vegyes bázisokat, más néven "wobbles" vagy degenerált bázisokat tartalmaznak. Vegyük például a HBV esetében bemutatott konszenzus szekvencia részleteit (6.5. ábra).
6.5. ábra.A HBV-illesztés kiválasztott régiója, amely a konszenzusos régiókat mutatja
A primerhez körülbelül huszonhárom bázisból álló régióra van szükség. Ebben az esetben az összes HBV-genom összes szekvencia-lehetőségét figyelembe véve ennek a huszonhárom bázisú régiónak a tényleges szekvenciája a 6.6. ábra szerint alakul:
6.6. ábra.A primer szekvencia permutációi, hogy a kiválasztott konszenzusos primer régió összes bázisopcióját figyelembe lehessen venni.
A kétértelmű bázisok pozíciói a vegyes bázisok standard egybetűs kódjaival ábrázolhatók (6.3. táblázat). Ha ezeket alkalmazzuk a 6.5 és 6.6 ábrán látható szekvenciára, az oligót a 6.7 ábra szerint írhatjuk le.
A 6.7 ábra szerint.A = adenozin, C = citidin, G = guanozin, T = timidin
6.7. ábra.A konszenzus régió oligója kétértelmű bázisait szabványos egybetűs kódok jelölik.
Ez a lehetőség nem valószínű, hogy sikeres PCR-primerhez vezet, mivel a degenerált bázisok nagy száma miatt további szempontokat kell figyelembe venni. Különösen, egy ilyen szekvencia felhasználásával előállított szintetikus oligo valójában a lehetséges egyes bázisszekvenciák mindegyikének keverékét eredményezné. A lehetséges, egyedi primer szekvenciák számát az egyes pozíciókban lévő egyedi bázisok számának szorzatával számoljuk ki. Erre a szekvenciára ez azt jelenti, hogy 1×2×1×1×1×1×1×1×1×2×2×1×1×1×1×1×2×2×3×2×2×1×1×2×2×2×2×2×1×1×2×2×1×1 = 6144 lehetséges egyedi oligót. Ezért a reakcióban az egyes specifikus oligók tényleges koncentrációja arányosan csökken. Empirikus elemzések kimutatták, hogy a különböző szekvencia-permutációk száma egy primerben nem lehet több 512-nél, ezért ez a példa nem lenne optimális degenerált bázisú primer. Egy másik helyre történő újratervezés lehetséges megoldást kínálna. A 6.8. ábrán látható példában a primer 2 bázist tartalmaz, amelyek potenciálisan nem illeszkednek. Ezek azonban mindegyike egyetlen alternatív bázissal rendelkezik, így a kevert szintézisben 4 oligót kapunk, és a wobbles a primer 5' régiójában helyezkednek el. Ezek a tényezők sokkal nagyobb esélyt kínálnak a sikerre, mint a 6.7. ábrán bemutatott primer.
.
6.8. ábra.Szekvencia, amely mutatja az igazítás konszenzus bázisait és a primer lehetséges helyét a konszenzus régióhoz. A konszenzusos primer wobble kódok segítségével látható.
A degenerált oligók PCR-ben történő használatakor módosított amplifikációs protokollra lehet szükség. A ciklizálás 2-5 ciklussal kezdhető alacsony lágyulási hőmérsékleten (35-45 °C). A lágyítási hőmérsékletről a hosszabbítási hőmérsékletre való lassú felfutást is be kell építeni, körülbelül 3-5 percig tart a hosszabbítási hőmérséklet elérése. A protokollt ezután 25-40 ciklussal kell befejezni egy szigorúbb lágyítási hőmérsékleten, a rámpa módosítása nélkül.
Ahol lehetséges, előnyös elkerülni a nukleotid heterogenitást. Ha nem lehetséges a heterogenitással rendelkező régiók elkerülése, ami gyakran előfordul nehéz célpontok esetében, akkor a speciális oligo-módosítások, például az inozin és más "univerzális" bázisok, például az 5-nitroindol, segíthetnek a bonyolultság csökkentésében és az olyan módosító csoportok hozzáadásában, mint a zárolt nukleinsav (lásd Kvantitatív PCR és digitális PCR kimutatási módszerek) javíthatja a teljesítményt.
Primermódosítások
Módosított nukleotidok beépítése lehetséges a PCR-primerekbe. Gyakori példa erre a Locked Nucleic Acid bázis hozzáadása. A zárolt nukleinsav egy módosított RNS-nukleotid. A Locked Nucleic Acid ribózrésze a 2' oxigént és a 4' szenet összekötő extra híddal módosul (Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods). A híd "bezárja" a ribózt a 3'-endo konformációba. A Locked Nucleic Acid tetszőleges helyen keverhető az oligonukleotidban lévő DNS- vagy RNS-bázisokkal. A Locked Nucleic Acid módosítás megnövelt termikus stabilitást eredményez, ami lehetővé teszi, hogy rövidebb szondákat tervezzenek egy hosszabb, nem módosított, egyenértékű primerrel egyenértékű Tm -vel. A Locked Nucleic Acid-tartalmú szekvenciák specifikusabbak, mint a csak DNS-ből álló oligók, és ideálisak SNP-k kimutatására. A zárolt nukleinsav-módosítások további alkalmazásai közé tartozik az oligók tervezése olyan bonyolult szekvenciák, például vírusok elemzésére, ahol a nagyfokú variabilitás megnehezítheti egy általános teszt megtervezését22.
Probe tervezése
A PCR-primerekhez hasonlóan a qPCR-szondák tervezése is nagyban függ a szekvencia kontextusától és a kívánt alkalmazástól. Az egyes szondák, mint például a kettős jelölésű szondák vagy a molekuláris jelzők (Molecular Beacons) jellemzően 20-30 bázis hosszúak. A Scorpions® szondák rövidebb, 15-25 bázis hosszúságúak. Egy LightCycler vagy FRET rendszerben két szonda van; a szenzor (1. szonda) és a horgonyszonda (2. szonda), amelyek 1-5 bázissal elválasztva egymáshoz közel helyezkednek el.
- Kettős jelölésű szondák használata esetén a Tm -nek 7 °C-10 °C-kal magasabbnak kell lennie, mint a primereké, hogy a szonda már a célponthoz kötődött, mielőtt a primerek hibridizálódnának és meghosszabbodnának. Ez a reakcióban mindkét FRET-szonda esetében is így van. Az SNP-kimutatáshoz használt szenzorszonda (1. szonda) a hibás illeszkedés helye fölött helyezkedik el, elkerülve a szonda terminális 3 bázisát, és alacsonyabb Tm (kb. 5 °C), mint a horgonyszonda (2. szonda). A Scorpions® szondák kivételt képeznek ez alól az ajánlás alól, mivel a szonda az újonnan szintetizált templáthoz a hosszabbítás után kötődik, nem pedig előtte, mint más szondarendszerek esetében.
- A Dual-Labeled Probes használatával végzett kvantitatív vizsgálatokhoz törekedjen arra, hogy a szonda az előremenő primer 3'-jához közel helyezkedjen el, de ne fedje át (körülbelül öt bázis); SNP-k kimutatásához a Dual-Labeled Probe vagy Molecular Beacon az amplikon közepére, az SNP pedig a szonda közepére kerüljön.
- Kerülje a guanidint a szondák 5' végén, a riporter mellett, mivel ez kioltást okoz.
- Vigyázzon arra, hogy a szonda szekvenciájában kevesebb G legyen, mint Cs.
- Kerülje az azonos bázisú (<4) és palindromikus szekvenciák futását.
- Vigyázzon arra, hogy a szonda ne tudjon másodlagos szerkezetet felvenni.
- Győződjön meg arról, hogy a szonda nem hibridizálhat a primerekkel.
- Multiplex reakciókhoz való szondák tervezésekor gondoskodjon arról, hogy a szondák és a primerek között ne legyenek potenciális kölcsönhatások.
Molekuláris jelzők
A megfelelő szondarégió kiválasztása után az 5' és a 3' végéhez komplementer szárakat adunk hozzá, hogy létrehozzuk a Molecular Beacon szerkezetet20. Az alábbi példa egy szárszekvencia (piros színnel) hozzáadását mutatja egy kettős jelölésű szondához a molekuláris jeladó létrehozásához (6.9. ábra Thelwell 200021 alapján).
6.9. ábra.Kettős jelölésű szondás teszt adaptálása molekuláris jelzőfény formátumhoz. Nukleinsavkutatás az Oxford University Press által. Reprodukció az Oxford University Press engedélyével, könyvben/e-könyvben történő újrafelhasználás formájában a Copyright Clearance Center-en keresztül.
Skorpiók® Szondák
A Scorpions® Probe a szondát egy forward primerrel úgy kell összeszerelni, hogy azok felvegyék a szerkezetet: 5' dyestem-szonda-törzsszonda-blokkoló-primer. A primernek és a szondának ellentétes szálakon kell lennie, mivel a szonda az újonnan létrehozott templáthoz kötődik, amely a primerrel azonos szálon van. A 6.10 ábrán látható példa a jelölő, a quencher, a PCR-blokkoló és a szár szekvenciák hozzáadását mutatja be egy kettős jelölésű szondához, hogy létrehozzunk egy Scorpions® szondát (a Thelwell 200021ból adaptálva).
6.10. ábra.Kettős jelölésű szondás vizsgálat adaptálása Scorpions® szonda formátumhoz. Nukleinsavkutatás az Oxford University Press által. Az Oxford University Press engedélyével sokszorosítva a könyvben/e-könyvben való újrafelhasználás formátumában a Copyright Clearance Center-en keresztül.
Szondamódosítások
Ha a szondák egy nemkívánatos heterogenitású szekvenciarégió felett helyezkednek el, a kétértelmű bázisok kezelése a PCR-primereknél leírtak szerint történik. Hasonlóképpen, zárolt nukleinsav adható a szondákhoz ugyanazokból az okokból, mint a primerekhez.
A Dual-Labeled Probe, Molecular Beacon vagy Scorpions® Probe 5' szakasza fluorofórral van jelölve, általában 6-FAM™. az egyszeri vizsgálatokhoz vagy multiplexálás esetén, jellemzően ezeket a FAM, HEX™/JOE™, cianin 5 sorrendben választva (kritikus fontosságú a jelölés és a műszer kompatibilitásának meghatározása). A kettős jelölésű szondák vagy molekuláris jelzők 3' szakaszát és a Scorpions® szondák belső szárrégiójának 3' végét fojtó molekulával módosítják. Történelmileg a TAMRA festéket használták a FAM emisszió akceptoraként, ami FAM kioltást eredményezett. A sötét fojtási technológia fejlődése a Black Hole Quenchers™ és a közelmúltban bevezetett Onyx Quencher™ kollekciónk (lásd Kvantitatív PCR és digitális PCR detektálási módszerek).
Sablonellenőrzések
A viszonylag rövid, jellemzően 150 bázisnál rövidebb amplikonok használatának egyik előnye, hogy ilyenkor hosszú oligonukleotid szintetizálható, amely szintetikus amplifikációs célpontként használható. Egy ilyen target használata segíthet olyan vizsgálatok fejlesztésében és optimalizálásában, ahol a tervezett target ritka vagy kevés lehet, például a SPUD23 gátlási kontrollvizsgálatban (lásd Appendix A) vagy fertőző betegségek kimutatására irányuló vizsgálatok19.
Oligo szintézis és kezelése
Az egyedi oligók PCR-alkalmazásokban való felhasználásához történő megrendeléskor döntéseket kell hozni a kívánt hozam/szintézis mértékét, a tisztaságot és a szükséges módosításokat illetően. E tényezők mindegyike hatással van a másikra, pl, a magasabb szintű tisztítás jobb minőségű oligonukleotidot eredményez, de az összhozam csökkenésének árán. A 6.4., 6.5., és 6.6. táblázatok útmutatást adnak az általunk gyártott oligonukleotidok szintézisének léptékére és várható hozamára vonatkozóan.
Oligonukleotid tisztítás/span>
A DNS szintézisekor minden egyes nukleotidot szekvenciálisan, a szekvencia 3' végétől kezdve kapcsolnak a növekvő lánchoz. Minden egyes kapcsolási ciklusban az oligláncok egy kis százaléka nem hosszabbodik meg, ami a teljes hosszúságú termék és a csonka szekvenciák keverékét eredményezi. Miután az oligót leválasztották a hordozóról és a védőcsoportokat eltávolították, tisztítással elválasztják a teljes hosszúságú terméket a csonka szekvenciáktól. Általában az adott alkalmazáshoz szükséges tisztaság függ a csonka oligomerek jelenlétéből eredő potenciális hatástól. Bizonyos alkalmazásoknál döntő fontosságú, hogy csak a teljes hosszúságú (n) oligót tartalmazzák. Másoknál, például PCR-primereknél a rövidebb oligók (n-1,n-2,...) jelenléte nem befolyásolhatja a kísérleti eredményeket.
Sótalanítás tisztítása
A sótalanítási eljárás eltávolítja a szintézis, a hasítás és a védtelenítés lépéseiből visszamaradt melléktermékeket.
A sótalanítás számos alkalmazás esetében, beleértve a PCR-t is, elfogadható a legfeljebb 35 bázis hosszúságú oligók esetében, mivel a teljes hosszúságú oligók túlnyomó mennyisége felülmúlja a rövidebb termékek hozzájárulását. A klónozáshoz szükséges vagy 35 bázist meghaladó hosszúságú oligók további tisztítási módszert igényelnek, például fordított fázisú kazettás tisztítást (RP1), HPLC-t vagy PAGE-t (a hosszúságtól függően).
Reverse-phase Cartridge Purification (RP1)
A fordított fázisú patronon történő elválasztás eltávolítja a csonka szekvenciák nagy részét. Az elválasztás alapjául a teljes hosszúságú termék és a csonka szekvenciák közötti hidrofobicitásbeli különbség szolgál. Míg a teljes hosszúságú oligo az oszlopon marad, a csonka szekvenciák kimosódnak. A kívánt teljes hosszúságú termék ezután eluálódik és eltávolításra kerül a patronról.
Reverse-phase HPLC
Amint nő az oligók hossza, úgy nő a csonka szekvenciák aránya. Nem minden ilyen szennyeződést távolít el az RP1, ezért hosszabb oligók, például mesterséges amplikon templátoligók vagy jelölt szondaoligók esetében HPLC vagy PAGE tisztítás ajánlott. A fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (RP-HPLC) ugyanazon az elven működik, mint a fordított fázisú patron. A nagyobb felbontás azonban nagyobb tisztasági szintet tesz lehetővé. A HPLC hatékony tisztítási módszer a fluorofórral rendelkező oligók, például a qPCR-szondák esetében, mivel a bennük rejlő lipofilitás kiválóan elválasztja a terméket a szennyeződésektől. Továbbá, az RP-HPLC az oszlop kapacitása és felbontó tulajdonságai miatt a nagyobb léptékű méretekben alkalmazott módszer. A lipofilitáson alapuló felbontás az oligo hosszának növekedésével csökken. Ezért az RP-HPLC általában nem ajánlott 50 bázisnál hosszabb termékek tisztítására. Bár a hosszabb oligók (80 bázisig) tisztíthatók ezzel a módszerrel, a tisztaság és a hozam kedvezőtlenül befolyásolható.
Anioncserélő HPLC
Az ioncserélő elválasztás a molekulában lévő foszfátcsoportok számán alapul. Az anioncserélő tisztítási módszer során sógradiens elúciót alkalmaznak kvaterner ammónium állófázisú oszlopon vagy hasonló szerkezetű oszlopon. A felbontás kiváló kisebb mennyiségek tisztítására. Ez a technika összekapcsolható RP-HPLC-vel történő tisztítással, ami egy második dimenzióval bővíti az elválasztási folyamatot. Az anioncserélő HPLC-t az oligok hossza korlátozza (általában legfeljebb 40 méter). Minél hosszabbak az oligonukleotidok, annál kisebb a felbontás az anioncserélő HPLC-oszlopon, és ezért annál kisebb a céloligo tisztasága.
Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)
A PAGE elválasztás alapja a töltés a molekulatömeggel szemben, ami jó méretfelbontást eredményez, ami 95-99%-os teljes hosszúságú termék tisztasági szintet eredményez. A PAGE-ból származó hozamok alacsonyabbak, mint más módszerek esetében, mivel az oligók gélből való kivonásához szükséges bonyolult eljárások és a csonka termékek túlnyomó többségének eltávolítása miatt. Ez a technika akkor ajánlott, ha nagy tisztaságú termékre van szükség. A PAGE a hosszabb oligók (≥50 bázis) tisztítására ajánlott.
*A garancia 20 méteres vagy hosszabb időtartamra szól. Rövidebb oligóknál kevesebb OD lehet.
*A garancia 20 méteres vagy hosszabb időtartamra szól. Rövidebb oligóknál kevesebb OD lehet.
Megjegyzés: A szintézis utáni módosítások 50%-kal kevesebbet eredményezhetnek a fent megadott értékeknél.
Minden szondát RP-HPLC-vel tisztítunk.
Oligonukleotid előkészítés
A szárazon szállított DNS-oligonukleotidok újbóli szuszpenzió után felhasználásra készek. Az oligonukleotidokat ajánlott gyenge pufferben, például TE-ben (10 mM Tris, pH 7,5-8,0, 1 mM EDTA) reszuszpendálni. Azokban az alkalmazásokban, ahol a TE nem alkalmas, steril nukleázmentes víz is használható. A magas minőségű víz azonban enyhén savas lehet, és nem ajánlott az oligonukleotidok hosszú távú tárolására.
A 100 μM-os törzsoldat a következő irányelv szerint állítható elő: Vegyük a megadott nanomol (nmol) számot (a tubus címkéjén és/vagy az oligóval együtt szállított minőségbiztosítási dokumentumon található információ), és szorozzuk meg 10-zel. Az eredmény megadja, hogy hány mikroliter folyadékot kell hozzáadni a csőbe a 100 μM végkoncentráció eléréséhez. Például, ha az oligo hozama 43,5 nmol, a 100 μM-os állományhoz hozzáadandó térfogat 435 μL. Vegye figyelembe, hogy ez 100 pmol/μL törzsoldatnak felel meg. A törzsoldatot ezután szükség szerint tovább lehet hígítani, az alkalmazás követelményei alapján. PCR-hez általában 10 μM vagy 20 μM munkakoncentrációt használnak. A törzsoldatot aliquotokban -20 °C-on tárolja, és kerülje a többszöri fagyasztási-olvasztási ciklusokat.
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?