A hisztidin-címkézett fehérjék tisztításának optimalizálása

Ez a fejezet három módszert tárgyal a hisztidinnel jelölt fehérjék tisztításának optimalizálására a nagy tisztaság elérése érdekében:

• Optimalizálás imidazol használatával
• Optimalizálás különböző fémionokkal
/a>
• Optimalizálás többlépcsős tisztításokkal

Az általános purifikációhoz.hisztidin-jelölt fehérjék általános tisztítása, beleértve a tipikus munkaflendet, a rendelkezésre álló kromatográfiás közegek és termékformátumok leírását, eljárásokat és hibaelhárítási tanácsokat, lásd a 3. fejezet.

Optimalizálás imidazol használatával

A felszínen exponált hisztidinmaradványok vagy más komplexképző aminosavak jelenléte a gazdasejt fehérjéinek nem kívánt kötődéséhez vezethet a nem jelölt gazdasejtfehérjék tisztítóközegekhez. Ezek a nem jelölt fehérjék a célfehérjével együtt eluálódhatnak. E szennyeződések kötődési affinitása gyakran alacsonyabb, mint a jelölt rekombináns fehérjéké, ezért az elválasztási feltételek optimalizálásával eltávolíthatók.

Az alábbi példák azt mutatják, hogy a kötés során az imidazol koncentrációjának változása hogyan befolyásolja a hisztidin-jelölt célfehérje tisztaságát.

Ni Sepharose^® excel és TALON^® Superflow termékek használata esetén általában nem ajánlott az imidazol bevonása a kötés során.

1. Az imidazol mint kompetitív szer

Az imidazolt kompetitív szerként használják a hisztidinnel jelölt fehérjék eluálásához. Ezenkívül az imidazol alacsony koncentrációban adható a mintához és a kötőpufferhez, hogy csökkentse a szennyező fehérjék kötődését, és így növelje a finális tisztaságot.

A Mycobacterium bovis-ból származó hisztidin-jelölt protein kináz G [(His)₆-PknG] tisztítása 45 mM imidazol koncentráció alkalmazásával történt a minta- és kötőpufferben. A kísérlethez használt közeg a Ni Sepharose^® High Performance (3. fejezet, Tisztítás Ni Sepharose^® High Performance használatával).

A magasabb fehérjekoncentráció elérése érdekében a fehérjét lépcsős gradiensben eluáltuk (4.1A ábra). Az imidazol kötődés során kifejtett előnyös hatásának demonstrálására egy további tisztítást végeztünk ugyanolyan körülmények között, kivéve, hogy az imidazolt kihagytuk (4.1B. ábra). Fontos megjegyezni, hogy az imidazol elhagyása általában nem ajánlott a Ni Sepharose^® High Performance vagy a Ni Sepharose^® 6 Fast Flow esetében; ez a példa csak azért szerepel, hogy bemutassa a hiányának negatív hatását az eluált célfehérje tisztaságára.

Az összevont elúciós frakciók SDS-PAGE-je a célfehérje tisztaságának nagymértékű javulását jelezte, amikor a minta- és kötőpufferbe 45 mM imidazolt tettünk (4.1C ábra). A célfehérje hozama ebben az esetben a 45 mM imidazol jelenlétében lévő mintában is megmaradt. Megjegyzendő, hogy az imidazol optimális koncentrációja fehérjefüggő, ezért esetről esetre kell meghatározni.

4.1. A (His)6-PknG purifikációja 45 mM imidazol nélkül (A) és (B) 45 mM imidazollal a minta- és kötőpufferben. Minden kromatogramhoz 2 l E. coli kultúra lizátumát (minta térfogata 26 mL; filteráltuk egy 0,45 µm-es fecskendő filteren keresztül) töltöttük 2 mL Ni Sepharose® High Performance oszlopra (XK 16/20 oszlop) az ÄKTApurifier kromatográfiás rendszer segítségével (most már az ÄKTA pure helyett). A kinázt kétlépcsős gradiensben eluáltuk 50%-os és 100%-os elúciós pufferrel. (C) (His)6-PknG frakciók SDS-PAGE (12%-os gél), amely az eluátumokat mutatja a kötőpufferben lévő 45 mM imidazol nélkül (-) és 45 mM imidazollal (+). Az adatokat K. Hölscher, M. Richter-Roth és B. Felden de Neuman, GPC Biotech AG, Martinsried, Németország, szíves hozzájárulásával bocsátotta rendelkezésünkre.

2. Az optimális imidazol-koncentráció meghatározása a His SpinTrap használatával

A kötés és a mosás során az imidazol-koncentráció fontos tényező a célfehérje finomális tisztasága és hozama szempontjából. A His SpinTrap egy kényelmes és gyors eszköz az optimális imidazol-koncentráció meghatározására. Az optimalizálás a célfehérje tisztasága és hozama szempontjából egyaránt fontos. Ezt egy olyan kísérletsorozat mutatta be, amelyben egy hisztidin-jelölt fehérjét, az APB7-(His)₆ (M_r 28 000) tisztítottunk His SpinTrap-on 5, 50, 100 vagy 200 mM imidazol alkalmazásával a minta- és kötőpufferekben. Az eluálópuffer 500 mM imidazolt tartalmazott.

Az 5 mM imidazol-koncentráció az eluált minta alacsony tisztaságát eredményezte (4.2. ábra, 3. sáv), míg az 50 mM imidazolra való emelés megakadályozta a legtöbb szennyezőanyag megkötését és javította a tisztaságot (4.2. ábra, 4. sáv). A minta és a kötőpuffer 100 mM imidazol hozzáadása csökkentette a hozamot, miközben a tisztaság minimálisan javult (4.2. ábra, 5. sáv). Az alacsonyabb hozam a célfehérje kisebb kötődésével magyarázható, ami a magas imidazol-koncentráció kompetitív hatásának köszönhető a kötés és a mosás során. A további növelés 200 mM imidazolra még tovább csökkentette a hozamot (4.2. ábra, 6. sáv).

Ez a példa azt mutatja, hogy a kötés során a magasabb imidazol-koncentráció javítja a tisztaságot, míg a túl magas koncentráció csökkenti a hozamot. Az optimális imidazol-koncentráció a kötés során fehérjefüggő. Sok fehérje esetében a 20-40 mM imidazol a legjobb választás a His SpinTrap számára.

4.2. ábra. SDS-PAGE redukáló körülmények között (ExcelGel SDS Gradient 8-18) a hisztidin-jelölt APB7 fehérjéről. A kötés során az imidazol koncentrációja befolyásolja a finális tisztaságot és a hozamot (vö. 3., 4., 5. és 6. sáv).

Optimalizálás különböző fémionok használatával

Egy fehérje és egy fémion közötti kötődés erősségét számos tényező befolyásolja, beleértve a célfehérje szerkezetét és jellemzőit, a fehérje affinity tag jelenlétét és tulajdonságait, a fémion tulajdonságait, valamint a kötőpuffer pH-ját és összetételét. Ennek eredményeképpen a Ni²⁺, a hisztidinnel jelölt fehérjékhez a legerősebb affinitásúnak tartott fémion nem mindig a legjobb választás egy adott alkalmazáshoz. Ezért bizonyos körülmények között más átmeneti fémionok, mint például a Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺ és Zn²⁺, alkalmasabbak lehetnek.

Általában a Ni Sepharose^® High Performance vagy a Ni Sepharose^® 6 Fast Flow kromatográfiás hordozókat ajánljuk, Ni²⁺ ionokkal előtöltve, nagy kapacitás érdekében. Ha a fokozott szelektivitás és a nagyobb tisztaság előnyös lenne, a Co²⁺-val előtöltött TALON^® Superflow jó választás. Megváltozott szelektivitás esetén más fémionok is vizsgálhatók töltetlen IMAC Sepharose^® High Performance vagy IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow használatával.

A következő iránymutatások segíthetnek az előzetes kísérletek kidolgozásában, hogy meghatározzuk az adott elválasztáshoz legmegfelelőbb fémiont:

• Ni²⁺ általában hisztidin-jelölésű rekombináns fehérjékhez használják.

• Co²⁺ szintén használatos a hisztidin-címkézett fehérjék tisztítására, mivel gyengébb kötődést tesz lehetővé, és csökkenti az esetlegesen kötődő szennyeződések mennyiségét.

• Cu²⁺ és Zn²⁺ gyakran használják a nem jelölt fehérjék tisztítására. A Cu²⁺ a fehérjék egy sorához viszonylag erősen kötődik; egyes fehérjék csak a Cu²⁺-hoz kötődnek. A Zn²⁺ ionok gyakran gyengébben kötődnek, ezt a tulajdonságot gyakran kihasználják a célfehérje szelektív eluálásának elérésére. Mind a Cu²⁺, mind a Zn²⁺ felhasználható hisztidinnel jelölt fehérjékhez és folyamatméretű elválasztásokhoz.

• Fe³⁺ ritkábban használható, mint más fémionok. A Fe³⁺-val való munka során fokozott óvatossággal kell eljárni, mivel semleges oldatokban könnyen redukálódik. A Fe³⁺ gyakran használják foszfopeptidek tisztítására, mivel a foszfátcsoport erős affinitással rendelkezik a Fe³⁺ iránt. Az immobilizált Fe³⁺ kromatográfiát pH <3 mellett kell végezni, hogy kiküszöböljük a karboxilcsoportok nem-specifikus kölcsönhatásait. Javasoljuk továbbá az immobilizált Fe³⁺ ionok strippelését minden futtatás után, és az oszlop szükség szerinti újratöltését. Az erősen kötött Fe³⁺-ionok és vasvegyületek eltávolíthatók, ha a közeget egy éjszakán át 50 mM EDTA-ban hagyjuk.

Az alábbiakban két példát mutatunk be arra, hogy a legmegfelelőbb fémion és a kísérleti körülmények (beleértve az imidazol koncentrációt) kiválasztása hogyan befolyásolja egy adott célfehérje tisztítását.

1. Összehasonlító tanulmány ²⁺, Zn²⁺ és Ni²⁺ HiTrap IMAC FF-en Cu használatával

.

Ebben a tanulmányban az APB7, egy (hisztidin)₆-jelölt fehérje (M_r 28 000), amelyet E. coli BL-21-ben termelt, HiTrap IMAC FF 1 ml-es oszlopokon tisztítottuk (előcsomagolt IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow), és külön-külön töltöttük fel Cu²⁺, Zn²⁺ és Ni²⁺-val.

Szűrési kísérleteket végeztünk az egyes ionok optimális imidazolkoncentrációjának meghatározására [4.3. ábra (A-C)]. Mindhárom tisztítási kísérlet eredményei azt mutatják:

• A 20 mM imidazol esetén a Cu²⁺ és Zn²⁺ tartalmú mosásban szignifikáns célfehérje-szivárgás volt tapasztalható (nyilak a 4. ábrán.3 A), ami annak a jele, hogy az imidazol koncentrációja túl magas volt ahhoz, hogy a maximális hozamot lehetővé tegye. Ni²⁺ esetén nagyon kevés szivárgást tapasztaltunk. A tisztaság mindhárom esetben kiváló volt.

• 10 mM imidazol esetén a célfehérje szivárgása a mosásban jelentősen csökkent Cu²⁺ és Zn²⁺ esetén. A célfehérje tisztasága az eluált poolban mindhárom fémion esetében hasonló volt, de nem volt olyan tiszta, mint 20 mM imidazol esetén.

• 5 mM imidazol esetén egyik fémion esetében sem történt szivárgás. A Ni²⁺ adta a legtisztább fehérjét, bár még mindig nem olyan tisztán, mint 20 mM imidazol esetén.

Megjegyezzük, hogy az SDS-poliakrilamid gélben nagy mennyiségű mintát alkalmaztunk. Emiatt a gélek számos szennyeződést mutatnak az eluált anyagban, annak ellenére, hogy a tisztaság nagyon magas volt.

Az eredmények azt mutatják, hogy bármely adott fémion esetében az imidazol koncentrációja beállítható a nagy hozam, a nagy tisztaság vagy egy sikeres kompromisszum elérése érdekében. Az IMAC Sepharose^® médiumok általában valamivel magasabb imidazol-koncentrációt igényelnek a mosópufferben, mint a piacon kapható hasonló IMAC médiumok. A legtöbb elválasztásnál jó kiindulópont, ha 20-40 mM imidazol kerül a kötő- és mosópufferbe az IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow vagy IMAC Sepharose^® High Performance használatával. Ügyeljen arra, hogy nagy tisztaságú imidazolt használjon, amely 280 nm-en lényegében nem ad abszorbanciát. Az imidazol eltávolításához a fehérjéből sótalanító oszlopot használjon (11. fejezet, Sótalanítás/puffercsere és koncentráció).

4.3. ábra. Az APB7 tisztításából származó frakciók SDS-PAGE-analízise (redukáló körülmények között) az IMAC Sepharose® 6 Fast Flow segítségével, előcsomagolva HiTrap IMAC FF 1 ml-es oszlopokba, Cu2+, Zn2+ vagy Ni2+ töltéssel, és (A) 20 mM imidazol a mintában, (B) 10 mM imidazol a mintában, vagy (C) 5 mM imidazol a mintában. A gélek festését Coomassie

2. O²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ és Ni²⁺ optimalizálása HiTrap IMAC HPf tisztaságon Cu használatával

.

A sikeres tisztításhoz figyelni kell a célfehérje tulajdonságaira és a célfehérje affinilitására az alkalmazott fémionnal szemben. Négy különböző, IMAC Sepharose^® High Performance ^{IMAC Sepharose®-zal előcsomagolt HiTrap IMAC HP 1 m oszlopot töltöttünk fel külön-külön négy különböző fémionnal: Cu2+, Zn2+, Co2+ és Ni2+. A purifikációs teljesítményt az APB7 célfehérje (M_r 28 000) segítségével vizsgáltuk, amelyet E. coli-ben fejeztek ki.}

Az eredmények bizonyítják a minták szűrésének fontosságát a legmegfelelőbb fémion és purifikációs körülmények meghatározásához a specifikus célfehérjékhez. Az APB7 esetében a legnagyobb tisztaságot a Ni²⁺ vagy a Co²⁺ használatával értük el, de a különbség a Zn²⁺ és a Cu²⁺ eredményeihez képest kicsi volt (4.4. ábra). Az ezekben a példákban alkalmazott imidazolos gradiens elúciók módszertant is kínálnak az adott tisztításhoz megfelelő imidazol-koncentráció kiválasztásához.

4.4. ábra. Az APB7, egy E. coli BL-21-ben expresszált (hisztidin)6 címkével ellátott fehérje tisztítása négy különböző HiTrap IMAC HP 1 ml-es oszlopon, amelyeket külön-külön fémionokkal töltöttek fel. (A) Cu2+, (B) Zn2+, (C) Co2+ vagy (D) Ni2+. Az egyes 1 mL-es frakciók SDS-PAGE után kiválasztott poolok (nem látható) jelölve vannak. (E) SDS-PAGE analízis: redukáló körülmények ExcelGel SDS Gradient 8-18-on; Coomassie festés.

Optimalizálás többlépcsős tisztítással

A célfehérje tovább tisztítható egy vagy több további tisztítási lépés hozzáadásával, amint azt az alábbi példák mutatják. Ezt a témát részletesen a 9. fejezet tárgyalja (Affinitáskromatográfia egy tisztítási stratégiában (C_IPP)).

Az alábbiakban két példát mutatunk be a célfehérjék sikeres többlépcsős tisztítására.

1. ₁₀-jelölt fehérje kétlépéses purifikációja AC és SECa nagy molekulasúlyú (hisztidin)

Megjelöléssel.A (His)₁₀-trx-p450 (N-terminálison hisztidin-jelöléssel ellátott, 10 hisztidin-maradékkal rendelkező) fehérje kétlépéses purifikációja során, amelyet E. coli előállításához egy HisTrap FF oszlopot használtunk a first lépésben. Az eluált pool-t ezután egy HiLoad 16/60 Superdex 200 pg oszlopra alkalmaztuk a további tisztításhoz SEC segítségével.

Az figyelembe vétel után három fő sávot detektáltunk (4.5B ábra, 5. sáv). A 6. sáv (2. pool a SEC-ből) a teljes hosszúságú célfehérjét tartalmazza. A 7. és 8. sáv (3. és 4. pool) a célfehérje csonka formáit tartalmazza, amint azt N-terminális szekvenálással igazoltuk (az adatok nem láthatóak). A 9. sáv (1. pool) a SEC-ből aggregált fehérjéket tartalmaz. Így az ezt követő SEC nagyon jó elválasztást biztosított a csonka formák és a teljes hosszúságú célfehérje, a (His)₁₀-trx-p450 között.

4.5. ábra. (A) Egy nagy molekulatömegű (hisztidin)10 címkézett fehérje kétlépéses tisztítása AC és SEC segítségével. (B) SDS-PAGE redukáló körülmények között és Coomassie festés.

2. Automatikus háromlépéses tisztítás nem klarifizált sejtlízátból ÄKTAxpressen

Az automatizált háromlépéses protokollt használtuk a hisztidin-jelölt maltózkötő fehérje tisztítására 100 ml nem klarifizált E. coli sejtlizátumból. A három lépés a következő volt: Affinitáskromatográfia (AC) HisTrap FF crude (1 mL oszlop) használatával, sótalanítás (DS) HiPrep 26/10 sótalanítással, és ioncserélő kromatográfia (IEX) Mono Q™ 5/50 GL használatával. Ezekre a képen AC-DS-IEX néven hivatkozunk. Amint az SDS-PAGE analízisből látható, a célfehérjét nagy tisztaságban és jó hozammal nyertük.

4.6. ábra. (A) AC-DS-IEX az IEX-csúcsok és az összegyűjtött medencék nagyításával a jobb oldalon. Terméshozam: 9,4 mg az 1. + 2. poolban. (B) Az IEX-ből eluált poolok SDS-PAGE-ja. A gélt Coomassie festékkel festettük.