Atto festékek a kiváló fluoreszcens képalkotáshoz

Az aktivált fluoreszcens festékeket rutinszerűen használják fehérjék, nukleinsavak és más biomolekulák jelölésére, amelyeket élettudományi alkalmazásokban használnak, beleértve a fluoreszcens mikroszkópiát, az áramlási citometriát, a fluoreszcencia in situ hibridizációt (FISH), receptorkötési vizsgálatokat és enzimvizsgálatokat. Az Atto színezékek olyan fluoreszcens színezékek sorozata, amelyek megfelelnek a modern fluoreszcens technológiák kritikus igényeinek:

• Szabályozhatóság - Az Atto 655 és az Atto 647N fotostabil és az ózon lebomlásával szemben rendkívül ellenálló, így ideálisak a microarray alkalmazásokhoz. Lásd a kapcsolódó cikket "Analyzing Properties of Fluorescent Dyes used for Labeling DNA in Microarray Experiments".
• Long Signal Lifetimes - A 0,6-4,1 nanoszekundumos jelcsökkenési idők lehetővé teszik a timegate vizsgálatokat az autofluoreszcencia háttér és a szórás csökkentése érdekében.
• csökkentett háttér - Számos Atto színezék gerjesztési hullámhossza nagyobb, mint 600 nm, ami csökkenti a mintákból származó háttérfluoreszcenciát, a Rayleigh- és a Raman-szórást.
• Szelekció - Az Atto színezékek erős fluoreszcens jelekkel rendelkeznek, amelyek lefedik a látható és a közeli IR emissziós hullámhosszokat.

Atto festékek hosszú jeléletideje

Atto festékek hosszabb fluoreszcens jeléletidőt (0,6-4,1 ns) mutatnak vizes oldatban, mint akár a karbocianin festékek, akár a sejtekben és biomolekulákban rejlő autofluoreszcencia nagy része. Az Atto színezékek jelét impulzuslézeres gerjesztéssel lehet mérni, időzített detektáló rendszerrel, amely csökkenti a rövidebb élettartamú fluorofórok, a háttér-autofluoreszcencia, valamint a Rayleigh- és Raman-fényszórás interferenciáját, javítva az általános érzékenységet.

A hosszú gerjesztési hullámhossz csökkenti a hátteret

A 635 nm-es diódalézeres gerjesztés és a vörös abszorbens fluoreszcens festékekről kimutatták, hogy kellőképpen csökkentik a biológiai minták autofluoreszcenciáját, így az egyes antigén- és antitestmolekulák kimutathatók humán szérummintákban.^1,2 A vörös színképi tartományban történő gerjesztés élő sejtekkel való munka esetén is csökkenti a sejtkárosodást.³

Az Atto színezékek (Atto 590 és magasabb) közül sokan 600 nm-nél nagyobb hullámhosszon gerjeszthetők. A nagy hullámhosszú aktivált Atto színezékek használata a megfelelő gerjesztési hullámhosszal együtt csökkenti a minta, az oldószer, az üveg vagy a polimer hordozó miatt fellépő autofluoreszcenciát, és javítja az általános érzékenységet a biológiai elemzési és képalkotási technikáknál. A Rayleigh- és Raman-szórásból eredő háttérfluoreszcencia szintén drámaian csökken a hosszabb hullámhosszú gerjesztés alkalmazásával.

Emissziós hullámhossz-tartomány 479 és 764 nm között a fluoreszcens multiplex detektáláshoz

Az Atto festékek erős fluoreszcens jelekkel rendelkeznek, a legtöbbjük moláris abszorpciós értéke >100,000 és alacsony gerjesztési/emissziós átfedés, így az Atto festékek ideálisak a látható és közeli infravörös emissziós hullámhosszakat használó multiplex technikákhoz.

A 390 és 740 nm közötti gerjesztési jelmaximumokkal és a jó Stokes-eltolódás elválasztással az Atto-festékek bármilyen szokásos gerjesztő fényforrással használhatóak.

Fluoreszcens multiplex detektálás Atto-festékekkel

Az Atto-festékek szondák és biomolekulák konjugálásához használhatók multiplex alkalmazásokhoz. Két, egymástól elkülönített emissziós jellel rendelkező Atto-festék kiválasztása támogatja a többszörös gerjesztést és mérési eredményeket egyetlen kísérletből.

Fluoreszcens multiplex detektálás antitest Atto-festék-konjugátumokkal

Az 1-es és 2-es fehérje immunoblot kimutatása két primer antitest és két anti-IgG-Atto festékkonjugátum felhasználásával. A képalkotás szekvenciálisan történt FLA-3000 Fuji® lézerszkennerrel, először 532 nm-es gerjesztési hullámhosszon 580 nm-es emissziós szűrővel, majd 633 nm-es gerjesztési hullámhosszon 675 nm-es emissziós szűrővel. A képátfedést egy szoftver segítségével végeztük el.

Alternatívák a gyakori fluorofórok helyett

Az Atto színezékek széles választékával bármelyik gyakori gerjesztő fényforrás használható, és az Atto színezékek helyettesíthetik az élettudományokban általánosan használt egyéb fluoreszcens színezékeket.

Az Atto színezékek az élettudományokban általánosan használt fluoreszcens színezékek helyettesítésére alkalmasak.

Fluorofon	Az ajánlott atto festék alternatívája
Alexa Fluor 488	Atto 488
FITC	Atto 488
FITC	Atto 488
FAM™	Atto 488
JOE™	Atto 520
TET™		Atto 520
Alexa Fluor 532	Atto 532
HEX™	Atto 532, Atto Rho6G
TAMRA™	Atto 550	Atto 550
Cy3	Atto 550
Cy3.5	Atto 565
ROX™	Atto 565, Atto Rho11
Alexa Fluor 594	Atto 590, Atto 594
Texas Red®	Atto 590
Alexa Fluor 633	Atto 633, Atto Rho14
Cy5		Atto 647, Atto 647N, Atto 655
Alexa Fluor 647	Atto 647, >Atto 647, Atto 647N, Atto 655
Cy5.5	Atto 680, <...a href="/product/SIGMA/30674">Atto 700

Fényforrás	Fő vonalak (nm)		Ajánlott Atto-festékek
Higanytartalmú ívlámpa	365, 405, 436, 546/td>	Atto 390, Atto 425, Atto 465, Atto 550, Atto 565
Hidrogén ívlámpa	577	Atto 590, Atto Rho101, Atto 594; Atto Rho13, Atto 610, Atto 611x
Xenon ívlámpa	Kontinuum és csúcsok >800 nm	Atto 610, Atto 620, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680
Halogénlámpa	Kis UV- és ibolyántúli emisszió; nagyobb intenzitás a hosszabb hullámhosszak felé	Atto 610, Atto 620, Atto 647, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680
Argonion-lézer	488, 514		Atto 488, Atto 520, Atto 532, Atto 550
Argon-kripton lézer	488, 514, 647, 676	Atto 520, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680	Atto 520, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680
Kripton lézer	647,676		Atto 647, Atto 647N , Atto 655, Atto Oxa12, Atto 665, Atto 680, Atto 700, Atto 725, Atto 740
He-Ne lézer	633	Atto Rho14, Atto 633, Atto 633, Atto 647, Atto 647N
Nd-NAG lézer	532	Atto 532, Atto Rho6G, Atto 550, Atto 565, Atto Rho11, Atto Rho 12	Nd-NAG lézer	532	Atto 532, Atto Rho6G, Atto 550, Atto 565, Atto Rho11, Atto Rho 12
Szokásos diódalézer	635, 650, 670	Atto 633, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680

Reaktív attoszínezékek és konjugátumok

Az attoszínezékek az erős abszorbancia és a magas kvantumhozam miatt intenzív fluoreszcens jeleket produkálnak. A színezékek a következő formátumokban állnak rendelkezésre:

• Free acid festékek minden rutin festési alkalmazáshoz
• NHS-észterek a szokásos konjugációs protokollokban való használatra
• Maleimidek tiol-tartalmú csoportokhoz, például ciszteinmaradványokhoz és tiol (-SH) címkékhez, amelyeket az automatizált szintézis során adnak hozzá
• Konjugált biotinhoz, sztreptavidinhez és antitestekhez

Atto 655, Atto 680 és Atto 700 festékeket guanozin, triptofán és rokon vegyületek oltják a festék és az oltóanyag közvetlen érintkezésével és elektronátviteli folyamat segítségével. A festékeknek a fehérjékben lévő triptofánmaradványok általi fluoreszcens kioltását arra használták, hogy megkülönböztessék a nem kötött (nem fluoreszcens) fehérjéket a fehérje-antitest (fluoreszcens) kölcsönhatásoktól.¹

	λabs	ε max	λem	ηem	τem	Katalógusszám<
Festék	nm		m-1  cm-1	nm	%		ns	Szabad sav	NHS észter	NHS észter	Maleimid	Azid	Amin	Amin	Jód-acetamid	Biotin
Atto 390	390	24.000	479	90	3.8	89313	89204	89740	68321
Atto 425	436	45.000	484	90	3.5	56749	16805	16805	49349	78948	78948			28616
Atto 430LS	433	32,000	547	65	4.0	06714	56387	41882
Atto 465	453	75.000	508	55	2.2	50712	53404	55607
Atto 488	501	90.000	523	80	3.2	41051	41698	28562	72709		74417	74402	30574
Atto 490LS	496	40.000	661	30	2.6	06715	78362	78362	78363	93688
Atto 495	495	80.000	527	45	2.4	16951	00379	41022
Atto 514	511	115,000	533	85	3.0	52595	67455	81062	44311	44311	93728	80027	00713
Atto 520	516	110,000	538	90	3.8	70706	77810	16590	61911				01632
Atto 532	532	115.000	553	90	3.8	06699	88793	68499
Atto Rho6G	535	115,000	560	90	4.1	88821	93516	87785						94169
Atto 540Q	542	105,000						40592	61683	62453
Atto 550	554	120.000	576	80	3.2	42424	92835	30730	41986		39271		28923
Atto 565	563	120.000	592	90	3.4	75784	72464	18507	43069			92637
Atto Rho3B	565	120,000	592	50	1.5	93685	28743		76531					07876
Atto Rho11	571	120,000	595	80	4.0	56611	89101		51431					19096
Atto Rho12	576	120,000	601	80	4.0	44432	68761	72763					91254
Atto Thio12	579	110,000	609	15	2.0	56963		94079					87784
Atto Rho101	586	120,000	610	80	4.2	77085	50492	73522				94379
Atto 580Q	586	110,000					03722	44756	68152
Atto 590	594	120.000	624	80	3.7	70425	79636	39887					43208
Atto 594	601	120.000	627	85	3.5	08637	08741	08717	72998		61583		03927	03927
Atto Rho13	600	120.000	625	80	3.9	16973	68538		44535					76141
Atto 610	615	150.000	634	70	3.3	78493	93259	41061					43292
Atto 612Q	615	115,000				04327			53988	50332
Atto 620	619	120.000	643	50	2.9	92716	67351	49728				72978
Atto Rho14	625	140,000	646	80	3.7	59746	61909	14397				76140
Atto 633	629	130,000	657	64	3.2	18620	01464	n/a	68517	73245	68652
Atto 647	645	120.000	669	20	2.3	97875	07376	41784
Atto 647N	644	150,000	669	65	3.4	04507	18373		05316	91000	95349	73353	93606
Atto 655	663	125,000	684	30	1.9	93711	76245		td>80661	11774	14918	73948	06966
Atto Oxa12	663	125,000	684	30	1.8	92606	55785	01971				61938
Atto 665	663	160,000	684	60	2.9	16851	04022	01407					01376
Atto 680	680	125.000	700	30	1.8	94875	75999	04971					55819
Atto 700	700	120.000	719	25	1.5	30674	16986	50611	59825		19571		73911
Atto 725	729	120.000	752	10	0.5	47156	93725	90979					69616
Atto 740	740	120.000	764	10	0.6	91394	59808	77071				50842
Atto MB2	658	100,000					75118	73499	51797					02934

Kényelmes Atto Dye konjugátumok

Az Atto Dye konjugátumok és készletek széles választéka áll rendelkezésre, többek között:

• Proteinjelölő készletek
  • Atto 488 a fluoreszcein és az Alexa Fluor 488 kiváló alternatívája, amely nagyobb fotostabilitású és fényesebb fluoreszcenciájú konjugátumokat állít elő.
  • Atto 550 a rodamin színezékek, a Cy3 és az Alexa Fluor 550 alternatívája, amely intenzívebb fényességet és nagyobb fotostabilitást biztosít.
  • Atto 594 az Alexa Fluor 594 és a Texas Red alternatívája.
  • Atto 647N egy rendkívüli erősen fluoreszkáló festék, és az Atto 655 a Cy5 és az Alexa Fluor 647 alternatívája.
  • Atto 633 az Alexa Fluor 633 alternatívája.

• Lektinek a szénhidrátkötési vizsgálatokhoz.
• Primer és másodlagos antitestek közvetlen és közvetett ELISA, Immunoblotting, Immunhisztokémia és egyéb fehérjeazonosítási alkalmazásokhoz.
• Biotin és sztreptavidin avidin / sztreptavidin / biotin konjugációhoz olyan alkalmazásokban, mint az ELISA, immunhisztokémia, in situ hibridizáció és áramlási citometria.
• NTA-nikkel-konjugátumok polihisztidinnel jelölt rekombináns fehérjék közvetlen kimutatására.

Humán bőrszöveti metszet (paraffin fixálás) fluoreszcens mikroszkópos vizsgálata gombafertőzéssel. A patogén gombák célszénhidrátja, a kitotrióz specifikusan kötődik a Phytolacca americana Atto 488 konjugátumból származó lektinhez (zöld). A sejtmagok ellenfestése DAPI-val (kék). A képet J. Zbären, Inselspital, Bern készítette.

A His-tagged p38 MAPK fehérjét (500 ng - 25 ng) 4-20%-os Tris-glicin SDS-PAGE gélen választottuk szét. Fixálás és mosás után a gélt Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) inkubáltuk sötétben. A gélt mostuk, majd FLA-3000 Fuji^® lézerszkennerrel, 633 nm-es gerjesztéssel és 675 nm-es emissziós szűrővel képet készítettünk a Ni-NTA-Atto 647N-ről (λex 647 nm, λem 669 nm). Az 50 ng His-taggal jelölt p38-MAPK sávját fluoreszcens képalkotással figyeltük meg.

Atto-festékkel jelölt foszfolipidek

A foszfolipidek a biológiai membránok fő építőkövei. A biológiai membránok (pl. élő sejtek intracelluláris membránjai, plazmamembránok) vizsgálata mára az érdeklődés egyik fő területévé vált. Fluoreszcensen jelölt foszfolipidek sorozatát kínáljuk. A kiválasztott festéksorozat optikai tulajdonságai lehetővé teszik az alkalmazást minden általánosan használt gerjesztési és emissziós szűrőbeállítással. Egy vagy két zsírsavat (lipofil csoportok) és egy foszfát-monoészter-maradékot (hidrofil csoport) hordozó glicerin alapú foszfolipideket kínálunk, mint például az 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-foszfoetanolamin (DPPE), 1,2-dioleoil-szn-glicero-3-foszfoetanolamin (DOPE), 1-palmitoil-2-hidroxi-szn-glicero-3-foszfoetanolamin (PPE) és 1,2-dimirisztoil-szn-glicero-3-foszfoetanolamin (DMPE). A fluoroforok kovalensen kapcsolódnak a foszfolipidek hidrofil fejcsoportjához.

Termékszám.	Megnevezés
44039	Atto 488 DPPE
93580	Atto 532 DPPE
	51016	Atto 532 DPPE
51016	Atto 550 DPPE
40924	Atto 594 DPPE
52816	Atto 633 DPPE
05152	Atto 647N DPPE	Atto 647N DPPE
67335	Atto 488DOPE
40692	Atto 532 DOPE
42208		Atto 550 DOPE
05676	Atto594 DOPE
90077	Atto 633 DOPE
42247	Atto 647N DOPE
54368	Atto 488 DMPE
06713	Atto 532 DMPE
42971	Atto 550 DMPE
72567	Atto 594 DMPE
55284	Atto 633 DMPE
	89522	Atto 647 DMPE
51028	Atto 488 PPE
94092		Atto 532 PPE
Az Atto 532 PPE
78998	Atto 550 PPE
19504	Atto 594 PPE
56530		Atto 633 PPE
91327	Atto 647N PPE

Hivatkozások

1. Neuweiler H, Schulz A, Vaiana AC, Smith JC, Kaul S, Wolfrum J, Sauer M. 2002. Detection of Individual p53-Autoantibodies by Using Quenched Peptide-Based Molecular Probes. Angew. Chem. Int. Ed.. 41(24):4769-4773. https://doi.org/10.1002/anie.200290044

2. Sauer M, Zander C, Müller R, Ullrich B, Drexhage K, Kaul S, Wolfrum J. 1997. Detection and identification of individual antigen molecules in human serum with pulsed semiconductor lasers. Applied Physics B: Lasers and Optics. 65(3):427-431. https://doi.org/10.1007/s003400050292

3. Sauer M, Zander C, Müller R, Ullrich B, Drexhage K, Kaul S, Wolfrum J. 1997. Detection and identification of individual antigen molecules in human serum with pulsed semiconductor lasers. Applied Physics B: Lasers and Optics. 65(3):427-431. https://doi.org/10.1007/s003400050292

4. Widengren J, Schweinberger E, Berger S, Seidel CAM. 2001. Two New Concepts to Measure Fluorescence Resonance Energy Transfer via Fluorescence Correlation Spectroscopy:  Theory and Experimental Realizations. J. Phys. Chem. A. 105(28):6851-6866. https://doi.org/10.1021/jp010301a

5. Buschmann V, Weston KD, Sauer M. 2003. Spectroscopic Study and Evaluation of Red-Absorbing Fluorescent Dyes. Bioconjugate Chem.. 14(1):195-204. https://doi.org/10.1021/bc025600x

6. Widengren J, Schwille P. 2000. Characterization of Photoinduced Isomerization and Back-Isomerization of the Cyanine Dye Cy5 by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 104(27):6416-6428. https://doi.org/10.1021/jp000059s