Érdekes gének klónozása plazmidvektorba

Oxford Genetics

• A klónozási rendszer és a plazmidvektor kiválasztása
• Plazmid-restrikciós emésztés
• Fragment-restrikciós emésztés
• Gél-kiválasztás
• Gél-fragmentumok tisztítása
• DNS-oligók ligidáláshoz történő ligidálása
• 5' foszfátok hozzáadása a DNS-hez
• Defoszforilálás-DNS
• DNS előkészítése Bunt-klónozáshoz
• DNS-ligálás a DNS-nek az érdekes gént tartalmazó plazmid előállításához
• Site-Directed-Mutagenesis
/a>

 

Klónozási rendszer és plazmidvektor kiválasztása

A géntechnológiát a világ több ezer laboratóriumában használják. Fontosságát tekintve figyelemre méltó, hogy a népszerű DNS-összetevők közül soknak a klónozási stratégiái nincsenek szabványosítva. A szabványosítás hiányához hozzájárul a klónozó készletek és innovatív technológiák számos lehetősége.  Nem mindig szükséges IP- nehéz készletet használni, mivel a hagyományos, restrikciós enzimekkel történő emésztéssel történő klónozás még egyszerűbbé válik az Oxford Genetics szabványosított plazmidjaival.

Az Oxford Genetics célja egy olyan DNS-plazmidrendszer kifejlesztése volt, amely egyetlen plazmidon belül képes befogadni a legtöbb olyan funkcionális DNS-beillesztést, amelyre egy kutatónak szüksége lehet. A kiindulási vektorunk optimalizálásával a rendszerünk minden DNS-összetevője eltávolítható és kicserélhető több száz más, általunk előre megtervezett és tesztelt DNS-szakaszra. Ez a SnapFast™ koncepció. Minden konstrukciónkat előszűréssel ellenőriztük a rossz kodonhasználat és az ellentmondásos restrikciós helyek szempontjából. Ahol lehetséges, a ritka kodonokat és restrikciós helyeket eltávolítottuk, hogy lehetővé tegyük a hatékony expressziót, és biztosítsuk, hogy a restrikciós helyek ne korlátozzák más SnapFast DNS-szakaszok klónozását.

A világ egyik legnagyobb elérhető plazmidgyűjteményével rendelkezünk, amely többféle expressziós és klónozási lehetőséget biztosít szinte minden általunk kínált inszerthez. Termékválasztékunk a következőket tartalmazza:

• A legnagyobb peptidcímke-kínálat bárhol (26)
• összesen 9 riportergén 5 konfigurációban
• Több mint 20 szignálpeptid
/li>
• Több mint 40 promóter az emlősök, baktériumok és élesztők expressziójához
• összesen 10 antibiotikum és metabolikus szelekciós lehetőség

A SnapFast rendszer előnyei

• Minden plazmid kompatibilis a standard klónozással, LIC, InFusionHD, Gibson Assembly, Seamless Geneart.
• Több mint 1600 egyedi DNS szakasz áll rendelkezésre és kompatibilis.
• Egyszerű, hatékony és egyszerű mérnöki stratégiák.
• Nagy sikerességi arányok az előre megtervezett kompatibilitásnak köszönhetően.
• Nincsenek inzert méretbeli megkötések. Alacsony kópia eredet a nagyobb stabilitás érdekében.
• Kompatibilis számos, már meglévő klónozó vektorral és számos shuttle vektorral a géntranszfer megkönnyítése érdekében.
• Egyszerű klónozás a SnapFast vektorokból számos alternatív rendszerbe, beleértve a vírusvektorokat is.
• Beépített szabályozó szekvenciák és képességek (pl. génkonkatamerizáció, szigetelők és terminátorszekvenciák).

Feature	SnapFast	Gateway	TOPO	Gibson	LIC	InFusionHD	Electra	Electra
Klónozási stratégiák tervezése	Egyszerű	Közepes	Egyszerű	Nehéz*	Nehéz*	Nehéz*	Kemény*
Zökkenőmentes összeolvadás a címkékkel	Igen	Nem	Nem	Igen	Igen	Igen		igen		Igen
A szabadalmaztatott klónozási módszerek	Nem		Igen	Igen	Igen	Nem	Igen	Igen	Igen
Kereskedelmi kutatáshoz engedély szükséges	Nem	Igen**	Igen**	Igen**	Nem	Nem	Nem	Nem
Plazmidok száma	>1650	<100	<20	N/A	N/A	N/A	N/A	<200
Költség	$	$$$	$$$$	$$	$	$	$	$$	$
Egyedi klónozási pozíciók minden plazmidban	>20	1	1	N/A	N/A	N/A	N/A	1
	Beviteli vektorok szükségesek	Nem	Igen	Igen	Nem	Nem	Nem	Igen
Egy klónozási rendszerbe kötve?	Nem	Igen		Igen	Nem	Nem	Nem		Nem	Igen
Szekvenáló primerek	20 - teljes lefedettség	2	2		N/A	N/A	N/A	N/A	None		None
Az online biztosított sorrendek	Igen	Igen	Igen	Nem//A	N/A		N/A	Nem

* Homológia vagy TypeIIS helyek használatával történő primertervezés szükséges
** A szabadalmak korlátozzák a klónozási technológia vagy termékek használatát
^ Online elérhető eszközök segítenek a tervezésben
LIC = Ligázfüggetlen klónozás

Plazmid restrikciós emésztés

A preparatív emésztés a DNS felvágása a DNS-nek egy másik DNS-darabbal való ligálás előkészítése céljából, nem pedig egyszerűen a DNS azonosságának megerősítése céljából. Arra kell törekednie, hogy egyszerre állítsa be a fragmentum és a vektor emésztését. Ezzel időt takaríthat meg. Ez a protokoll 200-300 ng/µl és kb. 3-5 kb méretű plazmid oldatot feltételez Tris-EDTA (TE) vagy Elúciós pufferben (EB) vagy nukleázmentes H₂O-ban. Nagyobb plazmidok esetén nagyobb térfogatot kell használni, mert azonos koncentráció mellett kevesebb plazmidkópia lesz.

Ebben a konkrét példában a következőket lehetne tenni:

10-20 µL plazmid (200-300 ng/μL, teljes mennyiség 3-5 µg)
10 µL 10X restrikciós puffer
10 µL 10X Bovine Serum Albumin  (BSA, a végső koncentráció általában 100 µg/ml) (Catalog No. A7906)
1,5-2 µL Restrikciós enzim 1 (10-20 egység/µL)
1.5-2 µL Restrikciós enzim 2 (opcionális)
Készítsen 70 vagy 100µL össztérfogatot TE (Katalógus sz. T9285) vagy nukleázmentes víz (Katalógus sz. W4502)

Adjuk a fenti reagenseket egy steril 1,5 ml-es Eppendorf-edénybe, először adjuk hozzá a TE-t vagy vizet, majd a plazmidot/DNS-t, végül a restrikciós puffert és a BSA-t, és alaposan keverjük össze. Végül adjuk hozzá a restrikciós enzim(ek)et. A kiválasztott restrikciós enzimek a céltól és a plazmidtérképtől függnek, de lehetnek EcoR I, BamH I vagy Hind III. Inkubáljuk a reakciót a megfelelő hőmérsékleten (általában 37 °C-on, de mindig győződjünk meg arról, hogy nem kivételes esetről van-e szó, mint például a SwaI 25 °C-on), és indítsuk el az ébresztőórát (számoljunk felfelé). Futtassa a reakciót 40-60 percig. Most már foszforilálhatja a vektort alkalikus foszfatázzal (CIP). A restrikciós enzimeket ezen a ponton inaktiválhatja, ez a szokásos gyakorlat.

Futtassa le az emésztést agaróz gélen (egy nagyon nagy mélyedéssel, hogy nagy mintát tölthessen be), és vizsgálja meg az eredményeket egyetlen, a linearizált plazmid méretének megfelelő sávra. Ennek az emésztésnek három lehetséges eredménye van:

• nem működött egyáltalán. Nincs értelme tovább emészteni, mert a reakció nem sikerült. Ha az enzim korábban már működött egy másik plazmidon, akkor esetleg csapold ki újra azt a plazmidot, amelyet megpróbálsz elvágni, vagy végezz egy új fenolos extrakciót a csapolás előtt, és próbáld meg újra. Ellenkező esetben ellenőrizze, hogy az enzim még mindig rendben van-e egy másik plazmid használatával.
• működött, de a vektor 40 perc után nem vágódott el teljesen (ez egynél több sáv jelenlétében látható, a vektortól elvárt molekulatömeghez közelítően). A haladásból megbecsülheti, hogy mennyi időbe telik még, és megpróbálhat egy újabb emésztést.
• volt teljes emésztés. Van egy lineáris plazmidja, amely készen áll a ligációs eljárás során történő felhasználásra.

Tipp: A restrikciós enzimek nagyon érzékenyek a hőmérsékletváltozásra, ezért kerülje a jégre helyezést. Ideális esetben használjon -20 °C-os hűtődobozt. Kerülje továbbá, hogy a cső alján az ujjaival fogja őket, és igyekezzen gyorsan dolgozni, miközben az enzimkészleteket kezeli. Ha vigyázunk rájuk, sokáig elállnak.

Fragment Restrikciós emésztésFragment Restrikciós emésztés/span>

Ez egy preparatív emésztés protokollja, amely a DNS felvágását jelenti, hogy előkészítse azt egy másik DNS-darabbal való ligáláshoz, nem pedig egyszerűen a DNS azonosságának megerősítését. Általában ezek a DNS-darabok körkörös plazmidok, de lehetnek PCR-fragmentumok is. Arra kell törekednie, hogy a fragmentum és a vektor emésztését egyszerre állítsa be. Ezzel később időt takaríthat meg.

Ez a protokoll egy 200-300 ng/µl-es, kb. 3-5 kb-os plazmidoldatot feltételez Tris-EDTA (TE) vagy Elúciós pufferben (EB) vagy nukleázmentes H₂O-ban. Nagyobb plazmidok esetén nagyobb térfogatot kell használni, mert azonos koncentráció mellett kevesebb plazmidkópia lesz.

Ebben a konkrét példában a következőket lehetne tenni:

10-20 µL plazmid (200-300 ng/μL, teljes mennyiség 3-5 µg)
7,5 µL 10X restrikciós puffer
7.5 µL 10X Bovine Serum Albumin (BSA, a végső koncentráció általában 100 µg/mL) (Catalog No. A7906)
1,5-2 µl restrikciós enzim 1(10-20 u/µL)
1.5-2 µL restrikciós enzim 2 (opcionális)
Készítsen összesen 70 µL-t TE (Katalógus sz. T9285) vagy nuclease free water (Catalog No. W4502)

DNS fragmentum restrikciós emésztési protokoll

Adja a fenti reagenseket egy steril 1.5 ml-es Eppendorfba, először adjuk hozzá a TE-t vagy vizet, majd a plazmidot/DNS-t, végül a restrikciós puffert és a BSA-t, és alaposan keverjük össze. Végül adjuk hozzá a restrikciós enzim(ek)et. Inkubáljuk a reakciót a megfelelő hőmérsékleten (általában 37 °C-on, de mindig győződjünk meg arról, hogy nem kivételes esetről van-e szó, mint például a SwaI 25 °C-on), és indítsuk el az ébresztőórát (számoljunk vissza). Futtassa a reakciót 40-60 percig. Futtassa le az emésztést egy agarózgélen (egy nagyon nagy mélyedéssel a nagy minta betöltéséhez), és vizsgálja meg az eredményeket az inzertjének megfelelő méretű egyetlen sávra vonatkozóan.

Gel-Excission-of-DNS-Fragments

A sáv kivágásához egy tiszta szikére vagy borotvapengére lesz szüksége. Fontos szempont, hogy mennyi agarózt vesz a DNS-sel együtt. Minél nagyobb az arány a DNS és az agaróz mennyisége között, annál kevesebb szennyeződést fog átvinni a ligáláshoz.

A DNS agaróz gélekből történő kivonásának standard módszere az etídium-bromid (katalógusszám:  H5041) festék UV-fénnyel történő láthatóvá tétele. Ez nem ideális, mert az UV károsítja a DNS-t, és mutációkat okozhat, valamint csökkentheti a ligálás hatékonyságát. Alternatív megoldás a Clare Chemical Dark Reader Trans-illuminátor használata, de néha nehéz lehet látni a kis mennyiségű sávokat. Ha jelentős mennyiségű DNS-sel rendelkezik, ezek a rendszerek ideálisak. Alternatív megoldásként vak kimetszést is végezhet, ha a vágott DNS kis mennyiségét a nagy lyuk melletti sávban futtatja, és annak helyzetét felhasználva a következő lyukban nagy mennyiségű DNS-t kimetszi. Legyen nagyon óvatos ezzel a technikával, mivel egyes sávok elég kicsik lehetnek a gél hosszában/felülről lefelé, és ha nem vagyunk pontosak, nem veszíthetjük el őket. A kivágás után megnézheti a megmaradt gélt, hogy megnézze, megkapta-e a sávot, tegye ezt gyorsan, mert ha nem kapta meg a DNS-t, nem akarja károsítani az UV-vel.

Vigyázzon az egymáshoz közel eső DNS-töredékekkel. Ennek a technikának a kulcsa az, hogy a vektor gerincét elválassza a fragmentumtól, hogy megakadályozza a szennyeződést. Csak azért, mert nem látsz valamit kivágás közben, nem jelenti azt, hogy nincs ott, csak a DNS Gauss-eloszlásának csúcsát látod, és bár a sávok különállónak tűnnek, nem biztos, hogy azok is, és véletlenül kaphatsz DNS-t olyan sávokból, amelyek közel vannak egymáshoz.

Tipp: Ez egy viszonylag veszélyes eljárás, ami a molekuláris biológiát illeti. Az UV-fény, a rákkeltő etídium-bromid és a szike a katasztrófa receptje. Kérjük, tartsa be a helyi biztonsági szabályokat és előírásokat, és konzultáljon a helyi biztonsági tisztviselővel, ha bizonytalan a szükséges óvintézkedésekkel kapcsolatban.

Tipp: Fontolja meg, hogy biztonságosabb vegyszert választ a DNS vizualizálásához. Mind a Nancy 520 (katalógusszám 01494), mind a Syber Safe (katalógusszámok. S9305 és S9430) bizonyítottan kevésbé mutagénnek bizonyultak, mint az etídium-bromid.

A gélfragmentumok tisztítása

A DNS-fragmentumok agarózgélből történő gélkivonásához általában nem érdemes mást használni, mint egy előkészített kitet, mint például a GenElute™ Gel Extraction Kit, katalógusszám. NA1111. Ezek viszonylag olcsók és rendkívül hatékonyak. Léteznek más módszerek is, amelyek nem tartalmaznak készletet (például dialíziscsövek és a géldarab parafilm közé szorítása az oldatban lévő DNS kipréseléséhez), de e módszerek használata gyakran nagy mennyiségű szennyeződést és alacsony DNS-hozamot eredményez.

A DNS-gél extrakciós készletek általában vagy gyöngyökből vagy spinoszlopokból állnak. Az egyes kitek által befogadható DNS-fragmentumok mérete eltérő lehet, ezért ellenőrizze, hogy a kit kivonja-e a DNS-nek azt a mérettartományát, amellyel dolgozik. A legtöbb készlet 100bp - 5 Kb közötti tartományt fed le, de egyesek kisebb vagy nagyobb kapacitással rendelkeznek.

A spin oszlop és a gyöngyös készletek elve az, hogy a DNS-t valamilyen anyaghoz (általában szilikagyantához) kötik, majd kimossák a szennyeződéseket, vagy a gyöngyök pelletálásával, vagy az oszlop mosásával. Az utolsó elúciós lépés során a DNS-t leválasztjuk a gyantáról/gyöngyökről/oszlopról, és így tiszta DNS-fragmentumot kapunk. Azonban még a legjobb extrakciós készlet is hordozhat szennyeződéseket, és ezért kerülni kell a géles extrakcióval előállított oldat nagy mennyiségű felhasználását a ligálásban. Néha a "kevesebb több", amikor a fragmentumot a ligációhoz kell hozzáadni. Próbálja meg elkerülni, hogy a ligáció több mint 30%-os térfogatú géles extrakcióval izolált folyadékból álljon.

Géles extrakciós készlet variabilitása

Laboratóriumainkban hat különböző DNS géles extrakciós készletet teszteltünk, fej-fej mellett, mivel az eljárás annyira lényeges a munkánkhoz. Azt tapasztaltuk, hogy míg egyes készletek folyamatosan magas hozamot és tiszta DNS-t biztosítanak, mások néha jó hozamot biztosítanak, de néha nem, mások pedig következetesen alulteljesítik.

Ha egy plazmidból gélen kivonunk egy fragmentumot, valószínűleg számolnunk kell azzal, hogy a DNS-koncentrációs számok (ha spektrofotométert használunk) alacsonyak lesznek, mert egy nagy plazmiddal kezdtük (valószínűleg 5kb körüli), majd egy sokkal kisebb részfrakciót vágtunk ki (talán 1kb), és a kitek soha nem fogják 100%-ban visszatisztítani a DNS-t a gélből. Tehát az 5ug plamsid DNS-ből (5Kb) izolált 1Kb-os fragmentum 20ng/ul hozama 35ul össztérfogatban nem lenne túl rossz (a DNS 70%-át sikerült visszanyerni).

Sokszor tapasztaljuk, hogy gyakran a szennyeződések szintje vagy a DNS-előkészítés minősége fontosabb meghatározója a klónozás sikerének, mint maga a DNS-hozam. Azt is következetesen megfigyeltük, hogy néha több fragmentum hozzáadása egy ligációhoz csökkenti a klónozás sikerét, mintha ugyanabban a reakcióban valamivel kevesebbet adnánk hozzá. Bár ez egyszerűen azért lehet, mert az extra DNS-végek eltiporják a ligázt a vektorvégektől, a túl sok géles extrahált anyag hozzáadása hozzájárulhat a gélből származó prep alacsony szennyezőanyagszintje miatt.

Annealing DNA Oligos for Ligation./span>

Az oligók lágyításának alapkoncepciója az, hogy két oligonukleotidot felmelegítünk úgy, hogy azok denaturálódjanak, majd ezt egy hűtési időszak követi, hogy a két oligó bázispárba kerüljön egymással. Az egyedi oligókhoz lásd OLIGO). Ezt az eljárást gyakran használják rövid DNS-szakaszok előállítására:

• shRNS DNS-régiók létrehozása ligáláshoz
• mikroRNS DNS-régiók létrehozása ligáláshoz
• Linker hozzáadása egy restrikciós hely eltávolításához vagy hozzáadásához.
• Kisméretű, kétszálú DNS-régiókat igénylő vizsgálatok, például DNS-fehérje kötődési próbák.

A foszforilált oligók nagy tételben történő beszerzésének költségei megfizethetetlenek lehetnek. Emiatt sok csoport egyszerűen ligálja az oligókat olyan vektorokba, amelyeket nem foszforiláltak. Ez különösen akkor hatékony, ha az oligókat olyan vektorba kell ligálni, amelyet két különböző restrikciós enzimmel vágtak, amelyeknek inkompatibilis végei vannak (megakadályozva, hogy a vektor önmagába záródjon). A ligálásból származó háttér még mindig magas lehet, de az oligók gyakran jelentős feleslegben vannak az oligoligációkban, így a reakciónak még működnie kell.

Az oligókat előbb polinukleotid-kinázzal (PNK) is lehet foszforilálni, de az oligók tisztítása nehézkes, mert rövid hosszuk miatt valószínűleg nem kötődnek egy DNS-tisztító oszlophoz. A PNK-reakciókat azonban ligáz pufferben végzik, így erre nem feltétlenül van szükség, de a PNK-t hővel inaktiválni kell, mielőtt az oligót a ligálásba helyezzük, különben a PNK foszforilálja a vektorunkat.

A foszforamidit-kémiával, amellyel általában oligókat állítanak elő, általában 40-50 bázisú oligók előállítására lehet támaszkodni túl sok hiba nélkül, azonban ha ezt a technikát 100 bázisú vagy annál hosszabb oligók előállítására használjuk, az gyakran vezet mutációkhoz. Gyakran tapasztaltuk, hogy jobb, ha egy hosszú oligót két rövidebb oligóra osztunk úgy, hogy a szemben lévő oligón 10-15 bázispár átfedés van középen, hogy lehetővé tegyük az összeillesztésüket. A szekvenálást követően a mutációk gyakoriságának sokkal kisebbnek kell lennie.

Figyeljen a hűtési lépésre. Próbáltuk az oligókat vízfürdőben egyszerűen úgy hűteni, hogy 95 fokra melegítettük, majd leállítottuk, hogy lehűljön, vagy úgy, hogy állványon álló főzőpohárban 100 fokra melegítettük őket (régi iskola), majd a főzőpoharat jeges vízbe tettük (és az oligókat egy csőben a főzőpoháron belül még mindig), hogy lehűljenek. Megpróbáltuk azt is, hogy az oligókat PCR-gépbe helyezzük, amely 30 másodpercenként 5 fokos hűtési lépésekkel van beállítva. A valóság az, hogy a módszer nem tesz hatalmas különbséget. Ha túl sokáig hagyjuk őket magas hőmérsékleten, az hidrolízishez vezethet, ezért kerüljük, hogy csak úgy kikapcsoljuk a vízfürdőt. Általában 95 fokra melegítjük az oligókat vízfürdőben egy főzőpohárban, az oligókkal teli csővel egy úszón lévő eppendorfban. Ezután ezt 10 percre jeges vízbe tesszük. Úgy tűnik, ez nálunk jól működik, de a többi módszer is működhet.

Nehéz lehet olyan túlnyúlásokkal rendelkező oligókat tervezni, amelyek rekonstruálják azokat a helyeket, amelyekbe az oligót be kell illeszteni. Az alábbi ábra egy példát mutat arra, hogyan nézhetnek ki az oligók, ebben a példában az oligók NcoI és XbaI restrikciós helyekbe ligálandóak.

DNS-oligók lágyítási protokollja

Tipp: Az oligók és primerek állományait gyakran 100 µM (100 pikomol/ul) koncentrációban reszuszpendálják.

1. Adjunk 10 µL stock oligót (feltételezve, hogy kettőt kell lágyítani) 25 µL nuclease free water (Catalog No. W4502) egy 1,5 mL-es mikrocsőbe.
2. Add 5 µL restriction digest buffer (such as 100mM NaCl (Catalog No. S3014), 50 mM Tris-HCl (Catalog No. 93362), 10 mM MgCl₂ (Katalógus sz. M0250), 1 mM Dithiothreitol (katalógusszám D0632), pH 7,9. A puffer jelenléte segít a pH megfelelő szinten tartásában a DNS stabilitása érdekében, a sónak pedig elő kell segítenie a lágyulást. Az oligok koncentrációja most 20 pikomol/ul.
3. A csövet egy főzőpohárban 95 fokosra előmelegített vízben 5 percig úsztassuk.
4. Tegyük a főzőpoharat egy jéggel és vízzel töltött jégdobozba, hogy a főzőpohár 10 percig hűljön.
5. Mihelyt a főzőpohárban lévő víz lehűlt, hígítsa fel az oligókat 10-szeresére és 100-szorosára vízben, és adjon ebből 1 µl-t egy standard 20 µl-es ligációs reakcióhoz. Nagy a kísértés, hogy többet adjunk hozzá, de ezzel csak a ligázt titráljuk el a vektorunk végeiről az extra oligókra, ami csökkentheti a ligálás hatékonyságát. Az oligók végső koncentrációja a ligációban körülbelül 2 vagy 0,2 pikomol/µl lenne. Ez még mindig jelentős többletet jelent az oligókból a vektorhoz képest.

5' foszfátok hozzáadása a DNS-hez

A T4 DNS-ligáznak szüksége van egy 5' foszfátra az egyik ligálandó DNS-molekulán ahhoz, hogy a DNS-t összekapcsolja, ezért gyakran szükséges a DNS-molekula foszforilálása a ligáláshoz való hozzáadás előtt, például egy PCR-termék tompa klónozásakor.

DNS-foszforilálási protokoll

Nukleázmentes víz (Katalógusszám. W4502): 4,5 ul
PCR-termék vagy egyéb DNS (megtisztítva): Ha a PCR-terméknek 5' süllyesztett vagy tompa vége van, melegítse 70 °C-ra 5 percig, majd hűtse le jégen, mielőtt hozzáadná a reakcióhoz)
10 x T4 DNS-ligáz puffer: 4 ul: 1 ul (ligáz puffert használunk, mert ATP-t tartalmaz)
T4 polinukleotid kináz: 0,5 ul

Inkubáljuk a kinázreakció(ka)t 30 percig 37 °C-on. A foszforilált PCR-termék ezután tisztítás nélkül közvetlenül felhasználható egy ligációs reakcióban (például helyirányított mutagenezis végzésekor). Ha a PCR-terméket foszforilált vektorba ligáljuk, a PNK enzim hőinaktiválása jó ötlet lehet, hogy megakadályozzuk, hogy foszforilálja a vektor gerincét, ami magas háttérhez vezethet. Ez úgy érhető el, hogy a reakció(ka)t 20 percig 65 °C-on inkubáljuk.

Defoszforiláló DNS

<Defoszforiláló DNS

A vektor de-foszforilálásának célja, hogy megakadályozza, hogy a vektor a ligációs lépés során visszaligálódjon önmagára azáltal, hogy eltávolítja az 5' foszfátcsoportokat, amelyekre a DNS-ligáznak szüksége van a foszfodiészter DNS-gerinc összekapcsolásához. Különböző alkalikus foszfatázok léteznek, köztük a borjúbél foszfatáz (CIP), a garnélarák és az Antarktisz foszfatázok. CIP (Katalógusszám. P4978) a leggyakrabban használt, de hővel nehezen inaktiválható. A különböző enzimek hőmérséklete és pufferjei eltérőek lehetnek, olvassa el a gyártó utasításait.

DNS-foszforilációs protokoll a DNS foszforilálásának megszüntetéséhez restrikciós emésztési reakcióban

50-100 µ.L DNS (5µg) egy restrikciós emésztési reakcióban/oldatban
1-2 µL CIP enzim (1unit/µL)

1. Adjunk 1-2 µL CIP-et a restrikciós emésztéshez. A CIP stabil és aktív a legtöbb restrikciós emésztési pufferben.
2. Inkubálja a mintát 30-60 percig 37 °C-on.

DNS-foszforilációs protokoll a DNS defoszforilálásához TE-ben vagy H₂O

20-40 µl DNS (5µg) in TE (Katalógus sz. T9285) vagy nuclease H₂O (Katalógus sz. W4502)
5 µl 10xCIP pufferből
1-2 µL CIP enzim (1unit/µL)
Készítsen 50 µL-t

1. A steril 1.5 ml-es eppendorfban adjuk hozzá a DNS-t, majd a CIP-puffert, végül az 1-2 µL CIP-et.
2. Pipettahegy segítségével alaposan keverje össze, és inkubálja 30-60 percig 37 °C-on.

Tipp 1: Győződjön meg arról, hogy a fragmentum, amelyet a defoszforilált vektorba kíván ligálni, rendelkezik 5'-foszfátcsoportokkal. A standard oligók/primerek és a PCR-termékek általában nem foszforiláltak, ezért T4 polinukleotid-kinázzal kell kezelni őket (lásd: 5'-végek foszforilálása). Általában egyszerűbb a PCR-termék végeire restrikciós helyeket (plusz néhány extra bázispárt a végeken) hozzáadni, mint foszforilálni egy fragmentumot.

Tipp 2: A CIP-et a stabilitás érdekében glicerin pufferben tároljuk, de ez azt jelenti, hogy a vizes oldatok aljára süllyed. A CIP hozzáadásakor figyelje meg, hogy a CIP a DNS-keverékbe cseppen, úgy, hogy a csövet maga elé tartva teszi, majd az inkubálás előtt gondoskodjon a megfelelő vissza-szuszpendálásról.

DNS tompa klónozási protokollok

Néha szükséges például egy DNS-molekula végeit tompává tenni:

• DNS-könyvtár készítésekor
• Szakadt végű DNS, amelyet vektorba kell klónozni

Azokban a helyzetekben, amikor a kompatibilis restrikciós helyek kiválasztása lehetetlen, a vektor és az inzert, vagy mindkettő tompítása szükséges a ligálás előtt (ez lehet a végső megoldás). Két lehetőség van, vagy DNS-polimeráz (mint a Klenow vagy a T4) vagy Mungó nukleáz használata. A Klenow és a T4 DNS-polimerázok mindkettő kitölti az 5' túlnyúlásokat és visszarágja a 3' túlnyúlásokat. Ha 5' túlnyúlást kell kitölteni, bármelyik enzim megfelel, de ha 3' túlnyúlást kell eltávolítani, akkor a T4 jobb választás lehet, mivel erősebb 3'-5' exonukleáz aktivitással rendelkezik. A mungóbab nukleáz mind az 5', mind a 3' túlnyúlásokat visszarágja.

Klenow tompítási protokoll

1. A DNS-t 1x restrikciós emésztési pufferben vagy T4 DNS-ligáz reakciópufferben kell feloldani, kiegészítve 33 μM minden egyes dNTP-vel [végső koncentráció].
2. Adjunk hozzá 1 egység Klenow-t mikrogramm DNS-enként, és inkubáljuk 15 percig 25 °C-on.
3. Állítsa le a reakciót EDTA hozzáadásával 10 mM végkoncentrációig, majd melegítse 75 °C-on 20 percig.

T4 tompítási módszer

1. A DNS-t 1x restrikciós emésztési pufferben & 100 µM dNTP-vel kiegészítve [végleges] kell feloldani.
2. Adjunk hozzá 1 egység T4 DNS-polimerázt mikrogramm DNS-enként, és inkubáljuk 15 percig 12 °C-on.
3. Állítsuk le a reakciót 10 mM végső koncentrációjú EDTA hozzáadásával és 20 percig 75 °C-ra melegítve.

Mungóbab nukleáz tompítási módszer

1. Suszpendáljuk a DNS-t (0.1 μg/μL) 1X Mung Bean nukleáz pufferben vagy restrikciós enzim pufferben
2. Adjunk hozzá 1,0 egység Mung Bean nukleázt μg DNS-enként.
3. Inkubáljuk 30 °C-on 30 percig.

NEM szabad megpróbálni a Mungóbab nukleázt hővel inaktiválni, mert a DNS egyszálú régiói megjelenhetnek az enzim inaktiválása előtt, ami nem szándékos lebomláshoz vezethet. Inaktiválja az enzimet spin oszlopos tisztítással vagy fenol/klórform extrakcióval és etanolos kicsapással.

DNS-ligációs protokoll

A klónozási folyamat során minden út a ligáláshoz vezet, így az azt megelőző összes lépés jelentősen befolyásolhatja annak hatékonyságát. Fontos, hogy a ligálási reakció előtt olvassa el az egyes szakaszokban található tippeket és megjegyzéseket.

A ligálási reakciókat a kontrollokkal együtt állítjuk be. Általában két kontroll van, amelyek a következők:

• A vektor önmagában, ligáz nélkül (a vágatlan vektor kontrollja)
• A vektor ligázzal (az 1. kontrollal együtt használt elégtelen defoszforiláció kontrollja)
• A valódi ligálás, amely vektor + fragmentum + ligáz.

Ha az 1-es kontrollon telepeket kaptál, akkor a vektorod restrikciós emésztése nem működött, mert ligáz nélkül is telepeket kaptál. Ha a 2-es kontrollon telepeket kaptál, de az 1-esen nem, akkor az alkalikus foszfatáz kezelésed nem működött. Ez azért van így, mert az emésztésed jól működött (az 1-es kontrollon nem voltak telepek), de a ligáz képes volt a plazmidot újra körkörösíteni, mert az 5' foszfátokat nem távolította el a defoszforiláció során. Ha a 3-ason telepeket kaptál, az 1-esen és a 2-esen pedig egyet sem (vagy csak kevesebbet), akkor gratulálnod kell magadnak, szedj néhány telepet, és menj haza egy csésze teára ünnepelni.

A reakció feltételei laboronként eltérőek lehetnek. A legjobb eredményeket 16 °C-on érhetjük el egy éjszaka alatt, de ez azt jelenti, hogy az egész folyamathoz egy plusz napot kell hozzáadni (így a klónozási ciklus 4 napos lesz). A ligálás 1-2 órán át szobahőmérsékleten történő elvégzése általában jó eredményt ad, és a klónozás teljes ciklusa 3 napra rövidül. Feltéve, hogy nem bánja az első nap hosszúságát.

A két legnehezebb ligálás a PCR-termékek ligálása és a tompa ligálás. Ezekkel számolnunk kell, hogy kevésbé hatékonyak lesznek, mint egy fragmentum standard klónozásával az egyik vektorból a másikba.

Egy tipikus reakciót a következőképpen állíthatjuk össze:

Minta	Vektor	Fragment	10x Ligáz puffer		Ligáz (1U/µL)	Víz
Ligálás	1 µL	3 µL	2 µL	1 µL	1 µL	13 µL
Kontroll 1	1 µL	1 µL	-	2 µL	1 µL	16 µL
Kontroll 2	1 µL	-		2 µL	-	17 µL

1. Kezdje a reakció beállítását az összes reakcióhoz közös komponensek hozzáadásával, azaz adja hozzá a vizet, majd a puffert, majd a vektort mindegyik csőbe.
2. Ezután adja hozzá a fragmentumot a ligációs csőbe.
3. Végül adja hozzá a ligázt a ligációs csőbe és a megfelelő kontrollcsőbe. Ne keverje fel a reakciót, mivel a DNS-ligáz nyírásra érzékeny. Ehelyett keverje össze azzal a hegyével, amellyel a ligázt hozzáadta, jól megkeverve és/vagy a csövet az ujjával óvatosan többször megpöccintve.
4. Inkubáljon 1-2 órán át szobahőmérsékleten vagy 16 °C-on egy éjszakán át. Egyesek 20 percig 65 °C-on hőinaktiválják a ligációt, de ez nem feltétlenül szükséges.
5. Amikor a ligálás befejeződött, használja a plazmidot baktériumok transzformálására, így vagy közvetlenül kifejezheti a fehérjét, vagy a plazmid DNS sok példányát növesztheti további felhasználás céljából.

1. tipp: A ligáz pufferben lévő BSA fagyasztáskor kicsapódhat, ami fehér csapadékként látható a puffer alján. Szuszpendálja újra vortexeléssel és átmeneti melegítéssel az ujjai között vagy 37 °C-on.

Tipp 2: A ligázpuffer ATP-t tartalmaz, amely több fagyasztási-olvasztási ciklus után lebomlik. Tartsa a pufferkészleteket kis aliquotákban, és >3 ciklus után dobja ki.

Tipp 3: A ligálás (az enzim hozzáadása előtt) néhány percig 37 °C-on melegítse a ligációt a ragadós végek felnyitásához, vagy segítsen a tranziens módon újrakirularizált vektorok linearizálásában, ha egyetlen restrikciós helyű ligációt használ. Az enzim hozzáadása előtt hűtse vissza a ligációt szobahőmérsékletre, hogy elkerülje a ligáz károsodását a ligáz hozzáadásakor. Mi ezt nem tesszük, de másoktól, akik ezt teszik, azt hallottuk, hogy segíthet.

4. tipp: A PCR-termékek Proteináz K-val történő kezelése a ligálás előtt a beszámolók szerint segít a ligálásban. A PCR-termék géles extrakciója szükségtelenné tenné ezt, ahogyan a PCR tisztító készlet használata is.

Tipp 5: Kerülje a DNS UV sugárzásnak való kitolását, amikor gélből extrahálja azt. Ez egyes esetekben drámaian csökkentheti a ligálás hatékonyságát.

Tipp 6: Kerülje a gélen tisztított anyagnak a teljes ligálási térfogat 20-30%-ánál (általában a teljes térfogat 20 μL) nagyobb részét. Ha így tesz, akkor túl sok só és egyéb szennyeződés kerülhet a reakcióba, és a ligálás hatékonysága csökkenhet.

Tipp 7: A vektor mennyiségének alig láthatónak kell lennie, ha agarózgélen futtatná, tehát körülbelül 20-30 nanogrammnak. A töredékeknek nagyobb mennyiségben kell lenniük, de nem több mint 5-10-szeres koncentrációban a vektorhoz képest. Általában 1:2 vagy 1:3 vektor/töredék arányt használunk.

Az inzert/vektor arány kiszámítása

Az inzert/vektor moláris aránya jelentős hatással lehet a ligálás és az azt követő transzformációs lépések eredményére. A moláris arányok az 1:1 inzert/vektor aránytól a 10:1 arányig változhatnak. A legjobb eredmény érdekében szükség lehet több arány párhuzamos kipróbálására. Az alábbi számításból megtudhatja, hogy 6:1 arányban (fragmentum:vektor) mennyi fragmentumot kell a vektorhoz viszonyítani. A 3-at változtassa meg bármire, ha alternatív koncentrációkat szeretne kiszámítani.

Site Directed Mutagenesis Protocol

A Site Directed Mutagenesis (SDM) egy hasznos technika egy specifikus mutáció plazmidba történő bevitelére egy adott helyen. A mutáció lehet szubsztitúció, inszerció vagy deléció. Az SDM-nek számos alkalmazási területe van, például egy enzim bizonyos aminosavainak funkciójának felmérésére, egy promóter bázisainak megváltoztatásának hatásának vizsgálatára vagy egy plazmidból a restrikciós helyek eltávolítására.

Itt egy PCR-alapú helyirányított mutagenezis módszert írunk le. Az alapelv az, hogy PCR-primerpárokat tervezünk hátulról hátrafelé, így a teljes plazmidot PCR-rel amplifikáljuk. Az egyik ilyen primer tartalmazza a kívánt mutációt. A PCR egy lineáris terméket hoz létre, amelynek végeit (foszforilálás után) DNS-ligázzal össze lehet kötni. A cirkularizált vektort E. coliba transzformáljuk.

1. lépés: Mutagenezis folyamata és primertervezés

Tervezzünk egy primerpárt, amely az egyik 5' végébe beépítjük a kívánt mutációt. Tervezze őket úgy, hogy a komplementer régió Tm-je 60 °C körül legyen.

Példa:

Megjegyezzük, hogy csak az előre irányuló primer tartalmazza a mutációt, így könnyen létrehozhatunk egy sor különböző mutációt, ha a fordított primer ugyanaz marad, de különböző előre irányuló primereket használunk. A fenti példa egy 3 bp-os szubsztitúció, de ugyanígy készíthető inszerció is. Ha nagyon nagy szubsztitúcióra vagy inszercióra van szükség, akkor mindkét primer 5' végére be lehet vezetni mutáns bázisokat.

Minden méretű deléciót el lehet végezni úgy, hogy a templáton az előre és a fordított primereket egymástól távolabb helyezzük el.

A PCR primerek általában foszfátcsoport nélkül érkeznek az 5' végükön a szintézisük módja miatt. Ez azt jelenti, hogy a PCR-termék végeit nem lehet egyszerűen összeilleszteni, hanem előbb foszforilálni kell őket. Erre két fő lehetőség van: 1) megrendelheti a primereket úgy, hogy az 5' végükhöz már hozzá van adva foszfát, vagy 2) foszforilálhatja a PCR-terméket polinukleotid-kináz (PNK) segítségével. A foszforilált primerek jó ötlet, ha csak néhány SDM-et készít, és nincs PNK a fagyasztóban (ráadásul így egy lépést ki lehet hagyni). A PNK használata költséghatékonyabb, ha sok SDM-et készítünk (valószínűleg 10 vagy több).

2. lépés: PCR

Az egyéb mutációk bevezetésének elkerülése érdekében fontos, hogy korrektor polimerázt használjunk. Ennek ellenére, ha még mindig aggódnánk a mutációk bevezetése miatt, a mutagenezis után a mutált fragmentumot vissza lehet szubklónozni ugyanabba a gerinccsontba.

Mivel a módszer a PCR-en alapul, általában jobban működik kisebb plazmidokon. A legjobb, ha követjük a polimerázhoz mellékelt utasításokat, de a PCR-t ehhez a példához hasonlóan állítjuk be:

35,5 μL víz
5 μL 10x polimeráz puffer
1,5 μL forward primer (0. 3μM végleges)
1,5 μL reverz primer (0. 3μM végleges)
1,5 μL reverz primer (0. 3μM végleges)
1,5 μL reverz primer (0.3 μM végleges)
5ul dNTP-k (200 μM végleges)
1ul Template DNS (egy mini-prep 1:100-as hígítása)
0,5 μL polimeráz

Állítsa a reakciót jégre, és a reakció összekeverése után azonnal helyezze át a csövet egy előmelegített PCR-blokkba.

PCR program:

1. 98 °C 60 másodperc
   
2. 98 °C 8 másodperc
   
3. 55-65 °C 20 másodperc
   
4. 72 ° C-os hőmérsékleten.C (az elongációs idő a plazmid méretétől és a használt polimeráz típusától függ) a 2-4. lépést még 27-30 alkalommal megismételjük/ciklikusan végrehajtjuk
   572 °C 5 perc

Tartsuk szobahőmérsékleten.

3. lépés: A PCR-termék tisztítása

Futtassa le a teljes reakciót egy agaróz gélen. Vágja ki a sávot, és tisztítsa meg a DNS-t egy géles extrakciós készlet segítségével, 30 μL-ben eluálva.

4. lépés: Foszforilálja az 5' terminusokat

*Ez a lépés elhagyható, ha foszforilált oligókat használt a PCR-ben.

4,5 μL Nukleázmentes víz (Katalógus sz. W4502)
 PCR termék
1 μL 10x T4 DNS-ligáz puffer*
0.5 μL T4 polinukleotid kináz

37 °C-on 40 percig inkubáljuk.

*Ligáz puffert használunk, mert az már tartalmaz ATP-t és a PNK aktív benne.

5. lépés: Ligálja a DNS-végeket

Állítsa be a ligációs reakciót jégre.

6.7 μL Nukleázmentes víz (Katalógus sz. W4502)
2 μL PNK reakció (az 5. lépésből)
0.8 μL 10x T4 DNS-ligáz puffer
0,5 μL T4 DNS-ligáz

Inkubáljuk 16 °C-on egy éjszakán át vagy szobahőmérsékleten 2 órán át.

6. lépés: Transzformáljuk kompetens E. coli

7. lépés: A mutáció megerősítése DNS-szekvenálással