Kék-fehér szűrés és protokollok a telepek kiválasztásához
Rekombináns baktériumok azonosítása
A kék-fehér szűrés gyors és hatékony technika a rekombináns baktériumok azonosítására. A β-galaktozidáz aktivitására támaszkodik, amely egy olyan enzim, amely az E. coli-ban fordul elő, és amely a laktózt glükózra és galaktózra hasítja.
A LacZ gén megzavarása
A laktóz jelenléte a környezetben elindítja a lacZ operont az E. coli-ban. Az operon aktivitása a laktózt metabolizáló β-galaktozidáz enzim termelését eredményezi. A legtöbb plazmidvektor a lacZ gén egy rövid szegmensét hordozza, amely a β-galaktozidáz első 146 aminosavának kódoló információját tartalmazza. A felhasznált gazdasejtek E. coli törzsek lacZΔM15 deléciós mutációt tartalmazó kompetens sejtek. Amikor a plazmidvektort ilyen sejtek veszik fel, az α-komplementációs folyamat következtében funkcionális β-galatozidáz enzim keletkezik.
A klónozáshoz használt plazmidvektorokat úgy manipuláljuk, hogy ez az α-komplementációs folyamat a rekombináció markereként szolgáljon. A plazmidvektorban a lacZ szekvencián belül egy többszörös klónozási hely (MCS) található. Ezt a szekvenciát restrikciós enzimekkel lehet bevágni az idegen DNS beillesztéséhez. Amikor az idegen DNS-t tartalmazó plazmidvektort a gazdaszervezet E. coli felveszi, az α-komplementáció nem történik meg, ezért nem keletkezik működőképes β-galaktozidáz enzim. Ha az idegen DNS-t nem illesztik be a vektorba, vagy ha az MCS-től eltérő helyre illesztik be, akkor a plazmidvektorban lévő lacZ gén komplementálja a lacZ deléciós mutációt a gazdaszervezet E. coli funkcionális enzimet termel.
Hogyan működik a kékfehér szűrés?
A rekombináns DNS-t tartalmazó klónok szűréséhez egy X-gal nevű kromogén szubsztrátot adunk az agarlemezhez. Ha β-galaktozidáz termelődik, az X-gal hidrolizálódik, és 5-bromo-4-klór-indoxil keletkezik, amely spontán dimerizálódik, és egy 5,5'-dibromo-4,4'-diklór-indigó nevű oldhatatlan kék pigmentet hoz létre. A nem rekombináns sejtek által képzett telepek ezért kék színűek, míg a rekombináns sejtek fehér színűek. A kívánt rekombináns kolóniák könnyen kiválaszthatók és tenyészthetők.
A kék-fehér szűréshez az X-gal mellett izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozidot (IPTG) is használnak. Az IPTG a galaktóz nem metabolizálható analógja, amely a lacZ gén expresszióját indukálja. Meg kell jegyezni, hogy az IPTG nem szubsztrátja a β-galaktozidáznak, hanem csak induktora. Vizuális szűrési célokra kromogén szubsztrát, például X-gal szükséges.
1. ábra.A kék-fehér szűréshez használható tipikus plazmidvektor sematikus ábrázolása.
2. ábra.Egy tipikus kék-fehér szűrési eljárás sematikus ábrázolása.
Kék-fehér szűrő termékek (anyagok)
A kék-fehér szűrés protokollja
A kék-fehér szűrés teljes protokollja 3 fontos lépést tartalmaz:
- Ligálás: Az idegen DNS ligálása a plazmidvektor MCS-ébe
- Transzformáció: az idegen DNS inszertet tartalmazó plazmidvektor bevitele kompetens E. coli
- Szűrés: kék-fehér szűrés a rekombináns baktériumtelepek azonosítására
Ligation
A következő kész expressziós vektorokat kínáljuk, amelyek stabil és tranziens expressziós rendszerekhez egyaránt használhatók. Ezek a FLAG-fúziós konstrukciók rendelkeznek replikációs origókkal a bakteriális és emlős sejtekben történő szaporításhoz.
Szükséges anyagok
A következő a ligáláshoz szükséges reakciófelépítés
- Adja a fenti komponenseket egy tiszta reakciócsőbe.
- Inkubálja 30 percig 25 °C-on (elvégezhető termociklálóban is).
- Tisztítsuk meg a DNS-t PCR tisztító oszlop segítségével, és eluáljuk körülbelül 50 µl-ben.
- Transzformáljuk a ligációs termék 0,1-10 ng-ját a vektorral kompatibilis kémiai vagy elektrokompetens sejtekbe.
Transzformáció
A transzformációs eljáráshoz elengedhetetlen a kiváló minőségű plazmid. Az alábbi készletekkel kiváló minőségű, transzformációra alkalmas plazmidot izolálhatunk és tisztíthatunk.
A kémiai vagy elektrokompetens sejtekkel történő transzformáció részletes protokollja megtalálható itt.
.Szűrés
Kromogén szubsztrátokat kínálunk, amelyek segítik a rekombináns baktériumok szűrését. Egyes termékek LB agar lemezekre teríthetők (1. szűrési protokoll), míg a többi termék a mikrobiális táptalajba beépíthető (2. szűrési protokoll). A termékeket szükség esetén IPTG-vel együtt használják. Az alábbiakban mindkét eljárás protokollja megtalálható.
1. szűrési protokoll (a termékszámok B6650, 16658 esetében alkalmazandó)./a>, B2904, B3928, 16669, B8931)
- Szórjunk 40 µl vagy megfelelő mennyiségű kromogén szubsztrát törzsoldatot és 10 µl IPTG-oldatot LB agar lemezekre steril szórófej segítségével (a B3928 termékszám használata esetén az IPTG hozzáadása nem szükséges, mivel az már tartalmaz IPTG-t).
- A lemezek között kontrollként legyenek megfelelő antibiotikummal ellátott és antibiotikum nélküli lemezek is.
- A lemezeket hagyja száradni lamináris áramlású kamrában, enyhén nyitott fedelekkel.
- Szórjon ki 10-100 µl transzformált E. coli sejteket az LB agar lemezekre steril szórófej segítségével.
- Inkubáljuk a lemezeket 37 °C-on 24-48 órán keresztül.
- Kék és fehér telepek jelennek meg az agar felszínén. Válassza ki a fehér telepekben lévő rekombináns sejteket tenyésztésre.
2. szűrési protokoll (alkalmazható a termékszámok S7313, S9811, C4478)
- Készítsen LB-agart a megfelelő por alakú táptalaj, agar és víz steril lombikba történő mérésével. Alternatív megoldásként mérje le a megfelelő mennyiségű C4478 -t, és adja hozzá a vízhez egy steril lombikban.
- Adjon 300 mg/L termékszámú S7313 és S9811, valamint 500 mg/L vas-ammónium-citrátot (termékszám F5879) a táptalajhoz az autoklávozás előtt. Kerülje el ezt a lépést, ha C4478 -t használ.
- Autoklávírozza a táptalajt, és csak annyira hűtse le, hogy a lombikot kezelni tudja.
- Adja hozzá a kiválasztott antibiotikum megfelelő koncentrációját a táptalajhoz.
- Kb. 25-30 ml LB agart öntsön steril lemezekbe, és hagyja kissé nyitott fedővel megdermedni.
- Szórjunk 10-100 µL transzformált E. coli sejtet az LB agar lemezekre steril szórófej segítségével.
- Inkubálja a lemezeket 37 °C-on 24-48 órán keresztül.
- Az agarfelületen kék és fehér telepek jelennek meg. Válassza ki a fehér kolóniákban lévő rekombináns sejteket a tenyésztéshez.
3. ábra.Rekombináns baktériumok kék-fehér színszelekciója X-gal segítségével.
A kék-fehér szűrés korlátai
- A kék-fehér technika csak szűrési eljárás; nem szelekciós technika.
- A vektorban lévő lacZ gén néha nem funkcionális, és előfordulhat, hogy nem termel β-galaktozidázt. A keletkező kolónia nem lesz rekombináns, hanem fehérnek fog tűnni.
- Még akkor is, ha egy kis idegen DNS-szekvencia beilleszthető az MCS-be, és megváltoztatja a lacZ gén olvasási keretét. Ez hamis pozitív fehér kolóniákat eredményez.
- A lacZ olvasási keretén belüli kis inzertek kétértelmű világoskék kolóniákat eredményezhetnek, mivel a β-galaktozidáz csak részben inaktiválódik.
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?