Bevezetés az élesztő transzformációba

A transzformáció története és a transzformáció az élesztőben

Az élesztők eukarióta modellrendszerek a vizsgálatokhoz, mivel gyors növekedést mutatnak és szétszórt sejtekkel rendelkeznek. Jól definiált genetikai rendszerrel és rendkívül sokoldalú DNS-transzformációs rendszerrel rendelkeznek, amely hatékonyan használható fehérje előállítására.

A transzformáció az a folyamat, amelynek során exogén DNS-t juttatnak egy sejtbe, ami öröklődő változást vagy genetikai módosítást eredményez. Erről először a Streptococcus pneumoniae -ben számolt be Griffith 1928-ban.¹ A DNS-transzformáció elvét Avery et al. 1944-ben.² Gombák esetében a bimbós élesztő gömböceit Saccharomyces cerevisiae először 1978-ban transzformálták sikeresen.³

Gombák esetében a bimbózó élesztőgomba Saccharomyces cerevisiae szferoplasztjait 1978-ban transzformálták először sikeresen.³ A legtöbb élesztőfaj, köztük a Saccharomyces cerevisiae is, a környezetben található exogén DNS segítségével transzformálható.⁴ Az élesztősejteket enzimekkel kezelik, hogy lebontsák a sejtfalukat, és így szferoplasztokat kapjanak. Ezek a sejtek nagyon törékenyek, de nagy sebességgel vesznek fel idegen DNS-t.⁵ Az élesztő rekombináns DNS-technológia meghonosodott, és számos különböző vektorkonstrukció áll rendelkezésre.

Transzformáció egy sejtben

1. ábra. Az élesztő transzformáció sematikus ábrázolása

Az élesztősejtek transzformációjának számos módszerét (1. ábra) dolgozták ki.^{4, 5} Az élesztősejtek transzformációjára használt néhány gyakori módszer a lítium, az elektroporáció, a biolitikus és az üveggyöngyös módszer. Ezeket a módszereket általában S. cerevisiae esetében alkalmazzák, de más gombák, például élesztők transzformálására is használhatók (pl., Schizosaccharomycespombe, Candida albicans és Pichiapastoris) és fonalas gombák (pl., Aspergillus fajok).

Követelmények

A transzformációs módszer három fő lépést foglal magában:

• Kompetens élesztősejtek előkészítése
• Transzformáció plazmid DNS-sel
• A transzformánsok kiválasztását követő lemezképzés.

A transzformáció szükséges anyagainak és részletes protokolljának áttekintése.

Alkalmazások

A transzformációt széles körben alkalmazzák a molekuláris biológiában. Az élesztő transzformáció néhány gyakori felhasználási területe a következő:

• Az élesztő transzformánsok tovább használhatók sejtlízisre és plazmidkészítésre.
• A transzformánsokból nyert plazmid DNS ezután PCR sablonként vagy E. coli transzformációjához használható.
• Az élesztő-transzformánsokat élesztő-kéthibrid rendszerekben használják fehérje-fehérje vagy fehérje-DNS kölcsönhatások tanulmányozására.
• Az élesztő-transzformációs technikák fehérjék és enzimek kereskedelmi célú előállítására is felhasználhatók.
• Az élelmiszeriparban és a növényi hulladékkezelő rendszerekben is alkalmazzák.
• A humán fehérjék (például az interleukin-1β) szintézisére és szekréciójára tervezett élesztő expressziós rendszerek hatalmas terápiás potenciállal rendelkezhetnek a gyógyszeriparban.

A transzformációs hatékonyság kiszámítása

A különböző élesztőfajok különböző hatékonysággal rendelkeznek.⁶ A transzformációs hatékonyságot a transzformációs reakcióban használt szupercoilolt plazmid DNS µg-jára vonatkoztatva keletkezett transzformánsok számaként határozzuk meg.⁷ A legtöbb transzformációs protokollt a pékélesztőhöz, S. cerevisiae és nem biztos, hogy más fajokhoz ideális.

Transzformációs hatékonyság képlete:
Kolóniák száma a lemezen	×1000 ng/µg
A kiültetett DNS mennyisége (ng)

A hatékonyságot befolyásoló tényezők

Az élesztő transzformáció hatékonyságát befolyásoló tényezők közül néhány a következő:

• A DNS mérete
• A plazmidok
• A DNS formái
• A sejt genotípusa
• A sejt növekedése
• A transzformáció típusa

Hivatkozások

1. Hinnen A, Hicks JB, Fink GR. 1978. Transformation of yeast.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75(4):1929-1933. https://doi.org/10.1073/pnas.75.4.1929

2. Griffith F. 1928. The Significance of Pneumococcal Types. J. Hyg.. 27(2):113-159. https://doi.org/10.1017/s0022172400031879

3. Avery OT, MacLeod CM, McCarty M. 1995. Studies on the Chemical Nature of the Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types. Mol Med. 1(4):344-365. https://doi.org/10.1007/bf03401572

4. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. 1983. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.. 153(1):163-168. https://doi.org/10.1128/jb.153.1.163-168.1983

5. Johnston S, Anziano P, Shark K, Sanford J, Butow R. 1988. Mitochondrial transformation in yeast by bombardment with microprojectiles. Science. 240(4858):1538-1541. https://doi.org/10.1126/science.2836954

6. Dohmen RJ, Strasser AWM, Höner CB, Hollenberg CP. 1991. An efficient transformation procedure enabling long-term storage of competent cells of various yeast genera. Yeast. 7(7):691-692. https://doi.org/10.1002/yea.320070704

7. HAYAMA Y, FUKUDA Y, KAWAI S, HASHIMOTO W, MURATA K. 2002. Extremely Simple, Rapid, and Highly Efficient Transformation Method for the Yeast Saccharomyces cerevisiae Using Glutathione and Early Log Phase Cells. J. BIOSCI. BIOENG.. 94(2):166-171. https://doi.org/10.1263/jbb.94.166