Bevezetés a sejttranszfekcióba
- Mi az a transzfekció és hogyan kell transzfektálni a sejteket
- A transzfekció típusai
- Kalcium-foszfátos transzfekció
- A kalcium-foszfátos transzfekció /a>
- Liposzóma-mediált transzfekció
- Elektroporáció
- Vírusos transzfekció (vírusos transzdukció)
- Transzfekciós reagens kiválasztása és transzfekciós protokollok
Mi a transzfekció és hogyan kell transzfektálni a sejteket
A transzfekció a DNS, RNS vagy fehérjék eukarióta sejtekbe történő bejuttatása, és a kutatásban a génexpresszió tanulmányozására és módosítására használják. Így a transzfekciós technikák olyan analitikai eszközként szolgálnak, amelyek megkönnyítik a genetikai funkciók, a fehérjeszintézis, a sejtnövekedés és a fejlődés jellemzését. A transzfekciós vizsgálatok nemcsak a sejtkutatás fejlődését teszik lehetővé, hanem a gyógyszerkutatási stratégiákat is javítják. Hasonló stratégiák, mint például a vírusos transzfekció vagy vírusos transzdukció, lentivirális részecskéket használnak idegen anyag eukarióta sejtekbe történő bejuttatására. Míg bakteriális transzformáció a horizontális génátvitel folyamata, amikor a baktériumok idegen genetikai anyagot vesznek fel.
A transzfekció típusai
A transzfekciós módszerek széles skálája létezik, amelyek között fizikai, kémiai és biológiai technikák is vannak. Ezek a technikák általában tranziens vagy stabil transzfekciós módszereket alkalmaznak a nukleinsavak sejtekbe történő beépítésére.
A tranziens transzfekciós technikák során DNS-t juttatnak a sejtekbe, de ennél a módszernél a DNS nem integrálódik a sejtek kromoszómáiba. Ez a technika nagy transzfekciós hatékonyságot tesz lehetővé, és a génátírások 1-4 nap elteltével elemezhetők. Emlőssejtkultúrákban történő nagyléptékű tranziens génexpresszióhoz (TGE) olyan transzfekciós hordozókat használnak, mint a polietilénimin (PEI) és kalcium-foszfát (CaPi) használható. Továbbá nagyszabású TGE módszereket is kifejlesztettek kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek felhasználásával, szérum1 hiányában.
A stabil transzfekciós technikák a transzfektált DNS sejtkromoszómákba való beépülését vagy episzómák kialakulását foglalják magukban. A stabilan transzfektált sejtek később szelektálható markerek, például dihidrofolát-reduktáz (DHFR), higromicin B-foszfotranszferáz (HPH) és adenozin-deamináz (ADA) segítségével azonosíthatók.
Az általánosan használt transzfekciós technikák közül néhány a kalcium-foszfát-csapadék, lipofekció, elektroporáció és vírusos átvitel. Ezenkívül ezek a módszerek alkalmazhatók kotranszfekciókban is. Ezek a technikák két különböző nukleinsav egyidejű bejuttatását jelentik ugyanabba a sejtbe, és gyakran használják stabil transzfekciók elérésére. A transzfekciós módszerek számos új módszerrel fejlődtek, mint például a biolistic delivery rendszerek, amelyek nagy sebességű mikropartikulákat használnak a nukleinsavak sejtekbe juttatásához, és in vivo transzfekciós protokollok, amelyek megkönnyítik az siRNS molekulák szisztémás szállítását.
Kalcium-foszfátos transzfekció
A kalcium-foszfátos transzfekciós technika a DNS és a kalcium-foszfát kicsapását jelenti. A kicsapást megkönnyíti, ha nátrium-foszfátot tartalmazó HEPES-pufferelt sóoldatot keverünk kalcium-klorid-oldattal és DNS2-vel. A glicerin-sokkot gyakran használják a DNS felvételének fokozására bizonyos sejtekben.
Míg ez a technika költséghatékony és a sejtek széles skáláján átmeneti vagy stabil transzfekciókhoz használható, a pH viszonylag kis változásai (±0,1) befolyásolhatják a transzformáció hatékonyságát. Továbbá, a vizsgálati eredmények reprodukálásához elengedhetetlen a reagensek konzisztenciájának fenntartása. Ez a transzfekciós módszer azonban nem működik RPMI vagy más, magas foszfátkoncentrációt tartalmazó médiumokban.
Liposzóma-közvetítésű transzfekció ./span>
A liposzóma-mediált transzfekciós (lipofekciós) technikák liposzóma-képző kationos lipidek vagy nem lipid polimerek felhasználásával történnek. A lipofekciós transzfekciós reagensek közé tartozhat például a DOTMA (N-[1-(2,3,-dioleyloxy)propil]-N,N,N-trimetil-ammónium-klorid)és X-tremeGENE™ transzfekciós reagensek, amelyek alkalmasak különböző DNS, kis RNS és CRISPR/Cas9 komponensek transzfekciójára a sejtvonalak sokféle változatába. A lipid transzfekciók költséghatékony, valamint nagy áteresztőképességű rendszerekhez is adaptálhatók;ezek a transzfekciók azonban általában sejttípus-specifikusak.
Elektroporáció<
Ez a technika során a sejtmembránokat nagy intenzitású elektromos impulzusoknak teszik ki, ami a sejt bizonyos területein átmeneti destabilizációt okoz. Az átmeneti destabilizációs esemény során a sejtmembrán erősen permeábilis lesz, és lehetővé teszi különböző exogén molekulák, köztük a DNS4 bejutását.
Az elektroporáció egy egyszerű, nem kémiai módszer, amely nagy transzformációs hatékonyságot eredményezhet különböző sejttípusokban. Bár ez a technika nem változtatja meg a célsejtek morfológiáját és funkcióit, a módszer sejthalált okozhat, ha a transzfekciót nem optimális körülmények között végzik.
.Vírusos transzfekció (vírusos transzdukció)
Ez a módszer vírusvektorok felhasználásával történik a nukleinsavak sejtekbe juttatása. Az olyan vírusos hordozórendszerek, mint a lentivirális, adenovirális és onkoretrovirális vektorok használhatók nukleinsavak átvitelére, még a nehezen transzfektálható sejtekbe is.
Bár a vírusos hordozó módszerek igen hatékonyak, meglehetősen munkaigényesek lehetnek. Ráadásul a legtöbb vírus elszigetelést és a biológiai biztonsági szintek gondos ellenőrzését igényli. A vírusos transzfekciók elvégzése előtt számos korlátozó tényezőt is fontos figyelembe venni, mint például a vírusvektorok lítikus jellegét, a sejtvonalak csomagolását és a gazdasejt-specifikusságot.
Transzfekciós reagens kiválasztása és transzfekciós protokollok
A transzfekciós protokollok fejlődésével és a transzfekciós vizsgálatok egyre könnyebbé válásával elengedhetetlen a megfelelő transzfekciós reagens kiválasztása az optimális transzfekciós hatékonyság elérése érdekében.
A megfelelő transzfekciós reagens kiválasztása során fontos a sejttípus és a vizsgálathoz szükséges tenyésztési körülmények meghatározása. A ritka sejtkultúrákat, neuronokat és primer sejteket általában nehezebb transzfektálni, ezért olyan reagensekre van szükség, amelyek a nehezen transzfektálható sejtekben is megkönnyítik a transzfekciót.
A megfelelő transzfekciós reagens kiválasztása előtt továbbá a reagens szintjét és a citotoxicitási paramétereket is figyelembe kell venni. Az ideális reagensnek alacsony citotoxicitással és magas transzfekciós hatékonysággal kell rendelkeznie a kívánt sejttípusok esetében.
Az elektroporáció egy egyszerű, nem kémiai módszer, amely nagy transzformációs hatékonyságot eredményezhet különböző sejttípusokban. Bár ez a technika nem változtatja meg a célsejtek morfológiáját és funkcióit, a módszer sejthalált okozhat, ha a transzfekciót nem optimális körülmények között végzik.
Bár a vírusos hordozó módszerek igen hatékonyak, meglehetősen munkaigényesek lehetnek. Ráadásul a legtöbb vírus elszigetelést és a biológiai biztonsági szintek gondos ellenőrzését igényli. A vírusos transzfekciók elvégzése előtt számos korlátozó tényezőt is fontos figyelembe venni, mint például a vírusvektorok lítikus jellegét, a sejtvonalak csomagolását és a gazdasejt-specifikusságot.
Általános protokollok
Az alábbiakban a kalcium-foszfátos transzfekciók és a lipofekciós technikák általános protokolljai szerepelnek összehasonlításképpen. A részletes eljárásokért kérjük, olvassa el a termékspecifikus protokollokat.
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?