Restrikciós endonukleázok - A molekuláris olló

Háttér

A "restrikciós enzim" kifejezés az Enterobaktériumok λ-fágjának (lambda-fág) Werner Arber és Matthew Meselson laboratóriumaiban végzett vizsgálataiból származik. Egyes E. coli törzsek azon képességét tanulmányozták, hogy a fág DNS-ének enzimatikus hasításával gátolják a lambda-fág aktivitását, és az ezért a növekedési restrikcióért felelős enzimet restrikciós enzimnek nevezték el.^{1, 2, 3}

Werner Arber, Daniel Nathans és Hamilton O. Smith 1978-ban élettani vagy orvosi Nobel-díjat kapott a restrikciós enzimek felfedezéséért és jellemzéséért, ami a rekombináns DNS-technológia fejlődéséhez vezetett.

Bevezetés

A restrikciós enzimeket "molekuláris ollónak" is nevezik, mivel a DNS-t a restrikciós helyeknek nevezett specifikus felismerő szekvenciákon vagy azok közelében hasítják. Ezek az enzimek a DNS két szálán egy-egy bemetszést végeznek, ezért restrikciós endonukleázoknak is nevezik őket.⁴

A vírusok úgy fertőzik meg a gazdasejteket, hogy DNS-üket a sejtekbe juttatják. Ez a vírus-DNS eltéríti a gazdasejtnek a vírus utódok szaporítására szolgáló gépezetét, ami a gazdasejt pusztulásához vezet. A vírusfertőzés leküzdésére számos baktérium és archaea számos mechanizmust fejlesztett ki. Az egyik legfontosabb védekező mechanizmus a restrikciós enzimek használatát foglalja magában, amelyek a behatoló vírus-DNS-t specifikus restrikciós helyeken történő hasítással lebontják. Ugyanakkor a gazdasejt a saját DNS-ét a metilázoknak nevezett enzimek alkalmazásával védi meg a hasítástól, amelyek a gazdaszervezet felismerő szekvenciáiban lévő adenin- vagy citozin-bázisokat metilálják. Minden egyes restrikciós enzimhez a gazdasejt egy megfelelő metilázt termel, amely metilálja és védi a gazdaszervezet DNS-ét a lebontástól. Ezek az enzimek alkotják a restrikciós-módosító (R-M) rendszereket.

A restrikciós enzimek katalizálják a DNS foszfodiészter gerincében a 3'-oxigénatom és a foszforatom közötti kötés hidrolízisét. Az enzimek aktivitásukhoz Mg²⁺ vagy más kétértékű ionokat igényelnek.

Nómenklatúra

Smith és Nathans 1973-ban javasolta a restrikciós endonukleázok elnevezési irányelveit. Ezen irányelvek szerint az enzimek nevei dőlt betűs hárombetűs betűszóval kezdődnek. Az első betű annak a baktériumnemzetségnek az első betűjét jelöli, amelyből az enzimet izolálták, a következő két betű pedig a baktériumfajból származik. Ezeket további betűk vagy számok követhetik a szerotípus vagy törzs megjelölésére. Ezt egy szóköz és egy római szám követi az azonosítás kronológiájának jelzésére. Például, Hind III volt a harmadik a Haemophilus influenza d szerotípusból izolált négy enzim közül.⁶

Reszszorpciós enzimek típusai

Az ^{6.A restrikciós endonukleázokat összetételük, a hasítóhely jellemzői és a kofaktorigényük alapján négy csoportba, az I., II., III. és IV. típusba sorolják.}

	Típusok	Co-faktorok	Szerkesztési hely	Példa enzimek
Típus I	ATP, AdoMet, Mg2+	A felismerőhelytől távol eső helyeken hasítanak Reszszorpciós és metiláz aktivitást is végeznek	EcoB, EcoK
Típus II	Mg2+.	A felismerési helyen belül vagy attól rövid, meghatározott távolságban	EcoR I, BamH I
Típus III	ATP, Mg2+		A felismerési helytől 25-27 bp távolságra lévő helyeken hasít	EcoP I, Hinf III
Típus IV	Mg2+	A felismerő szekvenciához közel vagy azon belül Célzottan módosított DNS-t, például metilált, hidroxi-metilált és glükozil-hidroxi-metilált DNS-t

A II-es típusú enzimek nem igényelnek ATP-t a tevékenységükhöz, és a felismerési hely közelében vagy azon belül hasítanak. Ezek az enzimek a génanalízishez és klónozási munkákhoz leggyakrabban használt enzimek, és több altípusba sorolhatók:⁷

Alattípus	Jellegzetes tulajdonságok	Példa enzimek	felismerési szekvencia	Az enzimek felismerési szekvenciája	./p>
II. típus	A felismerőhelyen belül vagy a felismerőhely szomszédságában lévő hasadás Palindromos felismerőhely Homodimer enzim	EcoR I
Típus IIS	A felismerési helytől meghatározott távolságban lévő hasadás Aszimmetrikus felismerési hely Aszimmetrikus felismerési hely	Fok I
Típus IIE	Két felismerőhellyel lép interakcióba Az egyik az allosztérikus effektor, a másik pedig a hasításhoz szolgál /li>	Nae I
Type IIF		Két felismerőhellyel lép kölcsönhatásba Mindkettő szükséges a hasításhoz Homotetramer enzim	NgoM IV
Típus IIT	Különböző restrikciós és módosító aktivitású alegységeket tartalmaznak	Bpu10 I
Típus IIG	Egyetlen polipeptidláncból áll, restrikciós és módosító aktivitással	Eco571
IIB típus	A felismerési hely mindkét oldalát szabaddá kell tenni	Bcg I
Típus IIM	Metilált helyek felismerése	DPNI-RO

A táblázatban a hasadás helyét a piros nyíl jelzi.

A restrikciós enzimek aktivitását befolyásoló tényezők

A szubsztrát DNS-től és a reakció körülményeitől függően a restrikciós enzimek a hasítás és az esetleges csillagaktivitás tekintetében széles variációt mutatnak. A kívánt hasítás elérése érdekében fontossá válik a következő tényezők ellenőrzése:

1. Sztáraktivitás: Nem optimális reakciókörülmények között egyes restrikciós enzimek a meghatározott felismerési szekvenciától eltérő helyeken hasítanak bázissorozatokat. Más szóval, nem specifikus helyeken hasítanak. Ezt a jelenséget nevezzük csillagaktivitásnak. A csillagaktivitást kiváltó tényezők közül néhány a magas só- és glicerinkoncentráció, a szennyeződések jelenléte, a szubsztrát-DNS-hez képest túlzott enzimmennyiség, a megnövekedett inkubációs idő vagy az inkompatibilis puffer és kofaktor.
2. Metilált DNS: Számos DNS-molekula metilálódik a felismerési helyen, ami ellenállóvá teszi őket bizonyos restrikciós enzimek általi hasítással szemben. Például a legtöbb E. coli törzs Dam vagy Dcm metiltranszferázokat expresszál, amelyek specifikus felismerési helyeket metilálnak, így G6mATC, illetve C5mCA/TGG keletkezik. A G6mATC rezisztens a Mbo I általi hasítással szemben.
3. Hőmérséklet: A legtöbb endonukleáz optimálisan 37 °C-on emészti a cél-DNS-t. Vannak azonban kivételek, amelyek alacsonyabb vagy magasabb optimális hőmérséklettel rendelkeznek. Például, Taq I optimálisan 65 °C-on emészt, az Apa I (katalógusszám:  10899208001) pedig 25 °C-on emészt.

Izoszkizomerek és neoszkizomerek⁶

Az izoszkizomerek olyan restrikciós enzimek, amelyek azonos felismerési szekvenciával és hasítási helyekkel rendelkeznek. Példa: Sph I (CGTAC/G) és Bbu I (CGTAC/G)

A neoszkizomerek olyan restrikciós enzimek, amelyek azonos felismerő szekvenciával rendelkeznek, de a szekvencián belül más-más helyen hasítják a DNS-t. Példa:  Tai I (ACGT/) és Mae II (A/CGT)

A restrikciós emésztés termékei

A kettős szálú DNS restrikciós emésztése kétféle véget eredményez: Sticky end és Blunt end.

Blunt endek rendelkeznek egy 5'-foszfátcsoporttal, amely elősegíti a ligációt. Ezek általánosan kompatibilisek más tompa végű DNS-ekkel.

A tompa végeket a EcoR V

generálja.

A ragadós végek olyan kis egyszálú DNS-szakaszok, amelyek képesek önligálódni vagy egy másik DNS-molekula komplementer régiójával ligálódni. A ragadós végek 1-4 nukleotidból álló 3'- vagy 5'-os túlnyúlásokkal rendelkeznek.

5' Cohesive end generated by Bln I (Catalog No. 11558170001)

3' A Kpn I

által létrehozott kohéziós végződés

Pufferrendszer

Resztrikciós enzimkollekciónk öt egyedi puffer használatával optimalizáltuk az emésztést. Ha egyetlen enzimmel emésztjük a DNS-t, használjuk az enzimhez mellékelt puffert. DNS kettős emésztéséhez használja azt a puffert, amelyben mindkét enzim 100%-os aktivitást mutat. Alternatívaként az optimális puffer meghatározható a gyakori kettős emésztések táblázatából. Bizonyos esetekben a puffer összeférhetetlensége (összetétel vagy hőmérséklet) miatt szekvenciális emésztés ajánlott. Az egy enzimmel, két restrikciós enzimmel és szekvenciális DNS-emésztéssel végzett restrikciós emésztésre vonatkozó protokollokért lásd a Restriction Enzyme Digest Protocol. A megfelelő puffer kiválasztása döntő fontosságú mindkét enzim magas aktivitásának eléréséhez és a csillagaktivitás elkerülése érdekében. Az öt pufferből álló választék lehetővé teszi a felhasználó számára, hogy a kívánt emésztéshez kompatibilis puffereket válasszon. A legtöbb emésztéshez 1-2 pufferre van szükség, ami költséghatékony lesz.

Alkalmazások

A restrikciós endonukleázok azon képessége, hogy a DNS-t specifikus felismerési helyeken hasítják, lehetővé tette ezen enzimek széles körű alkalmazását, amelyek számos molekuláris biológiai technikában alapvető eszközként szolgálnak. A főbb alkalmazások közül néhányat az alábbiakban ismertetünk:

1. Molekuláris klónozás: A restrikciós enzimek népszerű alkalmazása a rekombináns DNS-molekulák előállítása. A folyamat során a donor DNS-t (általában egy plazmidot) és a vektor DNS-t (általában egy másik szervezetből származó gént) egy restrikciós enzim segítségével úgy vágják szét, hogy kompatibilis végeket kapjanak. Ezek a végek lehetnek "tompák" vagy "ragadósak". A két levágott DNS-t egy DNS-ligáz nevű enzim segítségével kötik össze, hogy egy rekombináns DNS-molekulát hozzanak létre. Ezt a rekombináns DNS-t ezután be lehet juttatni egy gazdaszervezetbe szaporodás céljából. További részletekért lásd Resztrikciós enzimes klónozási kézikönyv
   
2. DNS-térképezés, más néven restrikciós térképezés, a restrikciós endonukleázok felhasználásával a DNS-töredék vagy genom szerkezeti információinak megszerzésére szolgál. A térképezés magában foglalja a restrikciós enzimhelyek sorrendjének meghatározását a genomban. Az érdeklődésre számot tartó DNS-t, amelynek szerkezetét meg akarják határozni, többféle restrikciós endonukleázzal hasítják, hogy különböző méretű DNS-darabkákat állítsanak elő. Ezeket a fragmentumokat agarózgélen szétválasztják, hogy meghatározzák a DNS szerkezetét.
   Egy adott DNS-fragmentum ismert restrikciós enzimhelyei alapján a restrikciós endonukleázok segítségével ellenőrizhető az adott DNS-fragmentum azonossága.
3. A restrikciós jelzőhelyes genomszkennelés egy olyan genomelemzési módszer, amely restrikciós enzimek kombinációját használja egy adott szervezet genomjában a metilációs szintek különbségeinek láthatóvá tételére. Ez egy hasznos technika a normálistól való eltérések azonosítására bármely DNS-ben. Nagyon hatékony a daganatokban előforduló hiper/hypometiláció, a gének deléciói vagy amplifikációi, illetve a génexpresszió változásainak kimutatására a szervezet fejlődése során.⁸
4. Génszekvenálás: Egy nagy DNS-molekula szekvenálható úgy, hogy restrikciós enzimekkel emésztjük meg, és az így kapott fragmentumokat DNS-szekvenálóval dolgozzuk fel.
5. Restrikciós fragmentumhossz-polimorfizmus (RFLP) a DNS-minta restrikciós enzimekkel történő emésztését, e fragmentumok hosszuk alapján történő szétválasztását gélelektroforézissel és membránra történő átvitelét jelenti. Ezeket a fragmentumokat ezután egy radioaktív vagy fluoreszcens jelölésű szondához kötik, amely a restrikciós enzimhelyekkel zárójelbe tett specifikus szekvenciákat célozza meg. RFLP akkor jön létre, ha az így kapott fragmentumok hossza egyénenként eltérő. Minden egyénnek van egy egyedi mintázata, amelyet "biológiai vonalkódnak" neveznek. Ez a technika volt az első DNS-profilkészítési technika, amelyet a géntérképezésben, a genetikai rendellenességek génjeinek lokalizálásában, a betegségek kockázatának meghatározásában és az apasági vizsgálatokban használtak.⁹
6. Az impulzusmező gélelektroforézis a nagy DNS-fragmentumok, főként a bakteriális genom ritka vágású restrikciós enzimmel történő emésztéséből származó fragmentumok szétválasztását jelenti. A keletkező egyedi mintázatot a különböző baktériumtörzsek megkülönböztetésére használják. Hasznos lehet egy adott törzs azonosítására, mint egy elterjedt betegség okozója.^{10, 11}
7. A génexpresszió sorozatos elemzése (SAGE) a génexpresszió mennyiségi és egyidejű elemzése során nagyszámú transzkriptumot elemeznek kis címkék formájában. Ebben a technikában a restrikciós enzimeket horgonyzó és címkéző enzimként használják.¹²
8. Resztrikciós enzimmel közvetített integráció (REMI) a restrikciós enzimek felhasználásával kompatibilis kohéziós végeket hozunk létre a genomban egy restrikciós enzimmel linearizált plazmid DNS keverékének beillesztéséhez. A plazmid DNS-t egy restrikciós enzimmel együtt transzformálják a gazdasejtbe, amely megkönnyíti a DNS integrálását a kromoszómák kognitív restrikciós helyeire. Ez a technika hasznos genetikai szűrésekhez, valamint genetikai és molekuláris markerek beillesztéséhez a genom bizonyos pontjain, hogy a mutáns fenotípusuk alapján azonosítani lehessen az érdekes géneket.¹³

Hivatkozások

1. Arber W, Linn S. 1969. DNA Modification and Restriction. Annu. Rev. Biochem.. 38(1):467-500. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.38.070169.002343

2. MESELSON M, YUAN R. 1968. DNA Restriction Enzyme from E. coli. Nature. 217(5134):1110-1114. https://doi.org/10.1038/2171110a0

3. Dussoix D, Arber W. 1962. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 5(1):37-49. https://doi.org/10.1016/s0022-2836(62)80059-x

4. Roberts RJ, Murray K. 1976. Restriction Endonuclease. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 4(2):123-164. https://doi.org/10.3109/10409237609105456

5. Kessler C, Manta V. 1990. Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases ? a review (edition 3). Gene. 92(1-2):1-240. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90486-b

6. Roberts RJ. 2003. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. 31(7):1805-1812. https://doi.org/10.1093/nar/gkg274

7. Pingoud A. 2001. Structure and function of type II restriction endonucleases. 29(18):3705-3727. https://doi.org/10.1093/nar/29.18.3705

8. Costello JF, Plass C, Cavenee WK. Restriction Landmark Genome Scanning.053-070. https://doi.org/10.1385/1-59259-182-5:053

9. Bernatzky R. 1989. Restriction fragment length polymorphism.467-484. https://doi.org/10.1007/978-94-009-0951-9_24

10. Blanc DS, Struelens MJ, Deplano A, De Ryck R, Hauser PM, Petignat C, Francioli P. 2001. Epidemiological Validation of Pulsed-Field Gel Electrophoresis Patterns for Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. 39(10):3442-3445. https://doi.org/10.1128/jcm.39.10.3442-3445.2001

11. Herschleb J, Ananiev G, Schwartz DC. 2007. Pulsed-field gel electrophoresis. Nat Protoc. 2(3):677-684. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.94

12. Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. 1995. Serial Analysis of Gene Expression. Science. 270(5235):484-487. https://doi.org/10.1126/science.270.5235.484

13. Kuspa A. Restriction Enzyme-Mediated Integration (REMI) Mutagenesis.201-210. https://doi.org/10.1385/1-59745-144-4:201