Bakteriális transzformációs protokollok

A transzformáció a molekuláris klónozás kulcsfontosságú folyamata, amelynek során rekombináns DNS-molekulák többszörös kópiáját állítják elő. A szabad, extracelluláris genetikai anyag felvételének képessége az előfeltétele annak, hogy a baktériumok kompetens sejtjei transzformáción menjenek keresztül. A cél egy rekombináns plazmid érdeklődésre számot tartó szekvenciájának replikációjának elérése.

1. ábra. Átalakulás

A transzformáció megkezdése előtt:

• Készítsen LB agarlemezeket, és hagyja megdermedni. Ha előre kiöntött lemezeket használunk, gondoskodjunk arról, hogy a lemezek 37 °C-ra legyenek felmelegítve.
• A plazmid DNS-ben található antibiotikum-markertől függően keverjük be a megfelelő antibiotikumot az LB-agarba.
• Ha a rekombinánsok kék/fehér szűrésére van szükség, adjunk 1 mM IPTG-t, 300 µg/ml S-Gal-t vagy 40 µg/ml X-Gal-t és 500 µg/ml vasammónium-citrátot az LB-agarba.
• Ha elektrokompetens sejteket használunk, tegyük az elektroporációs kamrát jégre.
• Fűtsük a vízfürdőt 37 °C-ra.
• A steril SOC táptalajt melegítsük szobahőmérsékletre (vagy 20-25 °C-ra vízfürdőben).

A kémiailag kompetens sejtek felhasználásával történő transzformáció protokollja

Szükséges, de nem biztosított anyagok:

Reagensek	Készülékek
SOC médium (termékszám. S1797)	Shaker inkubátor (37 °C)
LB agar EZMix™ (termékszám. L7533)	Szekrényes inkubátor (37 °C)
A megfelelő szelekciós antibiotikum		Fűtött vízfürdő (37 °C)
IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) (termékszáma. I6758)	15 ml-es polipropilén tenyésztőcsövek (steril)
X-gal (termékszáma. B9146)	Kultúracsészék
S-Gal™ (terméksz. S9811)	Lazy-L steril szórók (terméksz. Z376779)
Ferric ammónium-citrát (terméksz. F5879)

Standard transzformációs protokoll

1. Visszük át a szükséges számú csövet a -70 °C-os fagyasztóból nedves jégre. Ha szükséges, tegyen bele egy további csövet a kontroll DNS-hez
2. Hagyja a sejteket 5 percig felolvadni. Óvatosan kopogtassa meg többször a csöveket, hogy egyenletes szuszpenziót kapjon
   1. A kontrollhoz: Adjunk 1 µl (10 ng) pUC19 kontroll DNS-t az egyik csőbe. Óvatos kopogtatással keverje össze, és tegye jégre
   2. Adjon 1 ng-50 ng tisztított plazmid DNS-t közvetlenül a többi csőben lévő sejtekhez. Keverjük össze gyengéd kopogtatással, és tegyük jégre
3. Inkubáljuk a sejteket jégen 30 percig
4. Transzferáljuk a sejteket 37°-os hőmérsékletre. C-os vízfürdőbe pontosan 45 másodpercig
5. Transzferálja a sejteket jégre 2 percre
6. Adjon SOC médiumot minden csőbe. A sejteket helyezze át steril polipropilén csövekbe, és lazítsa meg a kupakokat, hogy megkönnyítse a tenyészetek levegőztetését
7. Inkubálja a sejteket rázó inkubátoron (225-250 rpm) 37° C-on 1 órán át
8. Pipettázzon 10-100 µl-t minden transzformált sejtszuszpenzióból LB agar lemezre szelekciós antibiotikummal, és terítse szét steril szórófejjel
/li>
9. Inkubáljuk a lemezeket 37 °C-on egy éjszakán át
10. Válasszuk ki a kolóniát (kolóniákat) és tenyésztsük ki szükség szerint
11. Iszolváljuk a plazmid DNS-t minden egyes tenyészetből
12. Izoláljuk a plazmid DNS-t
/li>
13. Kultúráztassuk a preferált klónokat
14. Feldolgozzuk a plazmid DNS-t restrikciós enzimek segítségével; gélelektroforézissel válasszuk szét

A transzformáció protokollja elektrokompetens sejtek felhasználásával

Szükséges, de nem biztosított anyagok:

Reagensek	Készülékek
SOC médium (termékszám. S1797)	Shaker inkubátor (37 °C)
LB agar EZMix™ (termékszám. L7533)	Szekrényes inkubátor (37 °C)
A megfelelő szelekciós antibiotikum		Fűtött vízfürdő (37 °C)
IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) (termékszáma. I6758)	15 ml-es polipropilén tenyésztőcsövek (steril)
X-gal (termékszáma. B9146)	Kultúracsészék
S-Gal™ (terméksz. S9811)	Lazy-L steril szórók (terméksz. Z376779)
Ferric ammónium-citrát (terméksz. F5879)	Kultúracsészék

Standard transzformációs protokoll

1. Visszük át a szükséges számú csövet a -70 °C-os fagyasztóból nedves jégre. Ha szükséges, tegyen bele egy további csövet a kontroll DNS-hez.
2. Hagyja a sejteket 5 percig felolvadni. Óvatosan kopogtassa meg többször a csöveket, hogy egyenletes szuszpenziót kapjon.
3. Transzferálja az SOC tápfolyadékot a tenyésztőcsövekbe, egyet-egyet minden egyes transzformációs reakcióhoz, és hagyja szobahőmérsékleten.
   
   (Az SOC tápfolyadék mennyisége a következő lépésben hozzáadandó sejtek mennyiségétől függ. A végső térfogatnak a kompetens sejtekkel és a SOC táptalajjal együtt 1000 µl-nek kell lennie)
4. Tegye jégre az 1 mm-es standard küvettákat és a steril mikrocentrifugacsöveket, egyet-egyet minden egyes transzformációs reakcióhoz.
5. A kompetens sejteket helyezze át hűtött mikrocentrifugacsövekbe. Használjon 40 µl sejtet a 80 µl-es csomagból és 50 µl sejtet a 100 µl-es csomagból.
   1. A kontrollhoz: Adjon 1 µl 1-5 hígított pUC19 kontroll DNS-t egy csőbe.
   2. Készítsen 1-5-szörös hígítást a DNS-ből vagy a ligációs keverékből TE pufferben. Adja hozzá a mikrofúziós csövekhez.
6. Pipettázza a DNS és a sejtek keverékét hűtött 1 mm-es küvettába.
7. Állítsa be az elektroporátort 25 kV/cm térerősségre 6 ms időtartamra, és kezelje a sejteket.
8. Vegye ki a sejteket a küvettákból, és adja hozzá a SOC médiumot tartalmazó csövekhez.
9. Inkubáljuk a sejteket rázó inkubátoron (225-250 rpm) 37 °C-on 1 órán keresztül
10. Pipettázzunk 10-100 µl-t minden transzformált sejtszuszpenzióból LB agar lemezekre szelekciós antibiotikummal, és szórjuk szét steril szórófejjel.
11. Inkubáljuk a lemezeket 37 °C-on egy éjszakán át.
12. Válasszunk ki egy kolóniát és tenyésztsük ki szükség szerint.
13. Iszolváljuk a plazmid DNS-t minden egyes tenyészetből.
14. Feldolgozzuk a plazmid DNS-t restrikciós enzimek segítségével; gélelektroforézissel válasszuk szét.
15. Kultiváljuk a preferált klónokat.

Fontos tippek a transzformációs folyamat optimalizálásához:

• Visszaigazolja, hogy a sejtek még mindig fagyasztva vannak, és a szárazjég még mindig jelen van az átvételkor.
• A maximális transzformációs hatékonyság érdekében használjon fenoltól, etanoltól, fehérjéktől, sótól vagy detergensektől mentes, jó minőségű DNS-mintát. Elektrokompetens sejtek használata esetén a DNS magas sótartalma nagyfeszültségnél ívképződéshez vezet, ami károsíthatja a mintát és a berendezést.
• A transzformációhoz kiváló minőségű reagenseket tartalmazó ligációs reakciókban lévő DNS használható. A DNS-ligázt nem kell inaktiválni.
• A kompetens sejteket mindig tartsa jégen; kerülje el a sejtek véletlen felmelegedését.
• A sejtek egyenletes szuszpenziójának elérése érdekében óvatosan csapolja meg a csöveket. Ne keverje vortex vagy pipetta segítségével.
• A LB agar lemezeket melegítse 37 °C-ra az optimális kolónia növekedés érdekében.
• Elektroporátor beállítások az elektrokompetens sejtek felhasználásával történő transzformációhoz:
  • BTX ECM 630 modell: HV üzemmód, 2,5 kV, 25 µF, 100 Ω, 1 mm-es küvetta
  • BioRad Gene Pulser: 2,5 kV, 25 µF, 100 Ω, 1 mm-es küvetta

Hivatkozások

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.. New York: Cold spring harbor laboratory press.

2. Dubnau D. 1999. DNA Uptake in Bacteria. Annu. Rev. Microbiol.. 53(1):217-244. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.53.1.217

3. Lorenz MG, Wackernagel W. 1994. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment.. 58(3):563-602. https://doi.org/10.1128/mmbr.58.3.563-602.1994