Kézi gélöntés PAGE és SDS-PAGE gélekhez az mPAGE^® TurboMix Bis-Tris gélöntő készletek használatával

A szakasz áttekintése

• Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)
• Poliakrilamid gélkémia
/a>
• Kézi poliakrilamid gélek készítése
• mPAGE^® TurboMix Bis-Tris gélöntő készlet
• mPAGE^® TurboMix Quick Cast Protocol
• Minták előkészítése és a gél futtatása
• <>a href="#mpage">mPAGE^® TurboMix Bis-Tris gélek MOPS és MES futópufferrel
• Beszerzési információk

Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)

A poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) egy alapvető technika, amelyet a fehérjék és más makromolekulák elektroforetikus mobilitásuk alapján történő elválasztására használnak. A poliakrilamid gélek akrilamid monomerek és bisz-akrilamid térhálósító molekulák polimerizációja révén jönnek létre. Az akrilamid és a bisz-akrilamid együttesen pórusokat képez, amelyeken keresztül a fehérjék vándorolhatnak.

A poliakrilamid gélek két részből állnak: egy egymásra rakódó részből és egy felbontó részből. A gél egymásra helyező része alacsony százalékos akrilamid, amely arra szolgál, hogy a minták egyetlen sávba koncentrálódjanak, mielőtt belépnének a felbontó gélbe. A reszolváló gél egy magasabb százalékos akrilamid, amely a fehérjéket méret szerint választja szét. Az akrilamid-koncentráció lineárisan függ a pórusmérettől; a nagyobb akrilamid-koncentráció kisebb pórusokat eredményez a gélben. A kis pórusok kívánatosak az alacsony molekulatömegű fehérjék elválasztásához.

Poliakrilamid gélkémia

A PAGE egy diszkontinuus pufferrendszert használ, amelyben a gélpufferion különbözik a futópufferiontól. A két ion közötti elektroforetikus mozgékonyságbeli különbség egy mozgó feszültséggradienst képez, amelyen a fehérjék áthaladnak. A Tris-Glicin gélkémia a leggyakrabban használt PAGE-rendszer, amely Tris-HCl-ból álló géleket és Tris-bázisból és glicinből álló futópuffert használ. A trisz-glicin gélek erősen lúgos környezetben működnek, ami nemkívánatos fehérjemódosításokhoz, például deaminációhoz és alkilációhoz vezethet. Ennek eredményeképpen a fehérje sávok torzulhatnak vagy elveszíthetik a felbontóképességüket a Tris-Glicin gélekben.

A Bis-Tris gélek ezzel szemben Bis-Tris és HCl-t használnak a gélpufferben, és MOPS vagy MES-t a futópufferben. A Bis-Tris gélek semleges pH-n működnek, ami minimalizálja a fehérjék módosulását és elősegíti a fehérjék stabilitását a gélfutás során. Ez élesebb fehérjesáv-felbontást és pontosságot eredményez. A Bis-Tris géleknek hosszabb az eltarthatósági ideje, mint a Tris-Glicin géleknek, amelyek idővel elkezdenek hidrolizálódni. A Bis-Tris gélek rugalmasan kombinálhatók MOPS- vagy MES-alapú futópufferrel; a két ion közötti migrációs különbség különböző fehérje-szeparációs tartományokat eredményez. A MES-t akkor kell használni, ha az érdeklődésre számot tartó fehérje kicsi (<50 kDa), míg a MOPS-t a közepes és nagy méretű fehérjék felbontására kell használni.

A fehérjeelőkészítés során fontos figyelembe venni a minta pufferének típusát is. Tris-Glicin gélekben jellemzően Laemmli puffert használnak a fehérjék denaturálására és negatív töltésű SDS-ionok bevonására. A mintákat ezután 100 °C-on forralják, hogy megkönnyítsék a denaturációt. A Laemmli-puffer 100 °C-ra történő melegítése a pH erősen savas pH-értéket eredményez, és a hő és a savasság e kombinációja bizonyítottan a fehérjék hasadását okozza, elsősorban az Asp-Pro peptidkötéseknél (Rittenhouse és Marcus, 1984). Ez az elektroforézis során látszólagos fehérjebontási termékekhez vezet. Ezzel szemben a Bis-Tris gélek olyan LDS mintapuffert használnak, amely a minta előkészítése során lúgos pH-t tart fenn, és a fehérjék teljes denaturálásához nem szükséges 70 °C fölé melegíteni. Ez az előkészítés az Asp-Pro peptidkötés hasadásának minimalizálásával megőrzi a fehérjék integritását.

1. táblázat. A Tris-Glicin és Bis-Tris gélkémia összehasonlítása.

	Tris-glicin				Bis-Tris
Működési pH	9.5 (lúgos)	7.0 (semleges)
Mintapuffer pH	5,2	8.5
Ionfrontok	Tris (+) Glicin (-)		Tris (+) MOPS (-) MES (-)
Protein elválasztási tartomány	6 kDa - 400 kDa	6 kDa - 400 kDa
A fehérje stabilitása az elválasztás során	Deamináció és alkiláció történhet	+++
Az Asp-Pro peptidkötésekre gyakorolt hatás	Az SDS mintapufferben történő hosszas melegítés hasadást okoz	LDS mintapufferben enyhe fűtési körülményeket alkalmaznak és az Asp-Pro kötések érintetlenek maradnak
Futási idő	Mérsékelt	Gyors
Szabályozási idő	Korlátozott	4 hét +

1. ábra. Tris-Glicin (balra) és Bis-Tris (jobbra) gélek összehasonlítása. A Tris-Glicin és Bis-Tris géleket kézzel öntöttük 12%-os akrilamiddal, és egy éjszakán át hagytuk polimerizálódni. A gélekre azonos E. coli lizátumtitrátokat (3-6. sáv), mPAGE^® festetlen fehérje standardot (2. és 7. sáv) és mPAGE^® színes fehérje standardot (1. sáv) töltöttünk. A géleket Tris-Glicin vagy MOPS futópufferben futtattuk, egy órán keresztül ReadyBlue™ fehérje gélfestékkel festettük, majd egy órán keresztül deionizált vízzel festettük.

Kézzel öntött poliakrilamid gélek

Míg speciális célokra, például különböző méretű fehérjék akrilamid gradiensre történő elemzésére előre gyártott poliakrilamid gélek vásárolhatók, sok kutató úgy dönt, hogy saját maga önti kézzel a poliakrilamid géleket. A kézzel öntött poliakrilamid gélek olcsóbbak az előre gyártott gélekhez képest; azonban a reagensek és az öntőberendezések előkészítése fárasztó és időigényes lehet. A gélpuffer-előkészítés eltérései szintén következetlen gélteljesítményhez és -minőséghez vezethetnek.

mPAGE^® TurboMix Bis-Tris gélöntő készlet

A mPAGE^® TurboMix Bis-Tris gélöntő készlet kiküszöböli a gélek kézi öntésével járó változékonyságot és időigényességet, mivel előre kikevert puffer és akrilamid oldatokat biztosít. A kit tartalmaz egy 20%-os akrilamid resolváló oldatot az akrilamid gél reszolváló részének kialakításához. A reszolváló oldat deionizált vízzel hígítható a kívánt akrilamid százalékos arányra, 8% - 15% között. A készlet tartalmaz egy 4%-os akrilamid kötőoldatot is az akrilamid gél kötő részének kialakításához. Ezeket az oldatokat úgy állították össze, hogy lehetővé tegyék a gyors öntési módszert, a polimerizációs várakozási idő nélkül a reszolváló és az egymásra rétegző gélek kiöntése között. Az alábbiakban egy demóvideó és egy rövid protokoll található.

Demóvideó: Öntse ki a saját poliakrilamid géljeit mPAGE^® TurboMix Bis-Tris Kits

segítségével.

mPAGE^® TurboMix QUICK CAST PROTOCOL

1. Készítsük elő a felbontó gélt a kívánt akrilamid százalékos arányban, pipettázással mPAGE^® TurboMix Resolving Solution, deionizált víz, deionizált víz, 10% ammónium-perszulfát (APS) és TEMED tiszta üvegpohárba vagy kúpos csőbe. A 2-4. táblázatban megadott térfogatok megsokszorozhatók, ha egyszerre több gélt akarunk önteni. MEGJEGYZÉS: A 10%-os APS-t és a TEMED-et közvetlenül az öntés előtt adjuk hozzá.

2. táblázat. Felbontó oldatok és gélöntéshez szükséges stacking oldatok készítése. A felsorolt mennyiségek egy 7,4 x 8,2 cm-es, 1 mm vastagságú minigél öntéséhez elegendőek, és több gél egyidejű öntéséhez megszorozhatók n-nel (a kívánt gélek száma).

Rezolváló gél						Szigetelő gél				Szigetelő gél
Gél százalékos aránya	8%	10%	12%	15%	4%
mPAGE® TurboMix Resolving Solution	2.4 ml	3,0 ml	3,6 ml	4.5 ml	n/a
mPAGE	n/a	n/a	n/a	n/a	2 ml	2 ml
Deionizált víz	3.6 ml	3,0 ml	2,4 ml	1.5 ml	n/a
10% APS	30 µL	30 µL	30 µL	30 µL	20 µL
TEMED	3 µL	3 µL	3 µL	3 µL	2 µL

3. táblázat. Felbontó oldatok és gélöntéshez szükséges stacking oldatok készítése. A felsorolt mennyiségek egy 7,4 x 8,2 cm-es, 0,75 mm vastagságú minigél öntéséhez elegendőek, és több gél egyidejű öntéséhez megszorozhatók n-nel (a kívánt gélek száma).

(For 0.75 mm vastag minigél)
Rezolváló gél		Szigetelő gél
Gél százalékos aránya	8%	10%	12%	15%	4%
mPAGE® TurboMix Resolving Solution	1.8 ml	2,25 ml	2,7 ml	3.38 ml	n/a
mPAGE® TurboMix Stacking Solution	n/a	n/a	n/a	n/a	n/a	1.5 ml
Deionizált víz	2.7 ml	2,25 ml	1.8 mL	1.12 ml	n/a
10% APS	22.5 µL	22.5 µL	22,5 µL	22.5 µL	15 µL
TEMED	2.25 µL	2,25 µL	2,25 µL	2.25 µL	1,5 µL

4. táblázat. Felbontó oldatok és gélöntéshez szükséges stacking oldatok készítése. A felsorolt mennyiségek egy 7,4 x 8,2 cm-es, 1,5 mm vastagságú minigél öntéséhez elegendőek, és több gél egyidejű öntéséhez megszorozhatók n-nel (a kívánt gélek száma).

(Az 1.5 mm vastag minigél)
Rezolváló gél		Szigetelő gél
Gél százalékos aránya	8%	10%	12%	15%	4%
mPAGE® TurboMix Resolving Solution	3.6 ml	4,5 ml	5,4 ml	6.75 ml	n/a
mPAGE® TurboMix Stacking Solution	n/a	n/a	n/a	n/a	n/a	3.0 ml
Deionizált víz	5.4 ml	4,5 ml	3,6 ml	2.25 ml	n/a
10% APS	45 µL	45 µL	45 µL	45 µL	45 µL	30 µL
TEMED	4.5 µL	4,5 µL	4,5 µL	4.5 µL	2 µL

2. Készítse elő a stacking gélt úgy, hogy a mPAGE^® TurboMix Stacking Solutiont egy tiszta, különálló üvegpohárba vagy kúpos csőbe pipettázza, és adja hozzá a szükséges mennyiségű TEMED-et és 10% APS-t. MEGJEGYZÉS: A 10%-os APS-t és a TEMED-et közvetlenül az öntés előtt adja hozzá.
3. Óvatosan keverje össze a reagenseket, elkerülve a légbuborékok bejutását a gélkeverékbe.
4. A szerológiai pipetta segítségével töltse fel az egyes kazettákat a kívánt magasságig reszolváló géllel.
5. A szerológiai pipettát helyezze a kazetta közepére és óvatosan adja hozzá a stacking gélt, a rövid lemez tetejéig töltve. Ahol a pipettázás történik, előfordulhat egy bemerülés, de ez kiegyenlítődik.
6. Gyorsan és óvatosan helyezze be a fésűt, elkerülve a légbuborékok beszorulását a fogak alá.
7. Hagyja, hogy a gélek 1 órán át polimerizálódjanak.
8. A gélek azonnal felhasználhatók, vagy DI vízzel átitatott papírtörlőbe csomagolva 4 °C-on, légmentesen záródó edényben 4 hétig tárolhatók.

Minták előkészítése és a gél futtatása

A bis-Tris gélekhez LDS mintafeltöltő puffer szükséges, amely lúgosabb, mint az SDS mintapuffer. A minták DTT vagy β-merkaptoetanol segítségével redukálhatók, vagy az alkalmazástól függően redukálatlanul is használhatók. Készítse elő a mintákat az 5. táblázat szerint.

5. táblázat. Példa a PAGE minta előkészítésére. Az LDS mintapuffer végső koncentrációja 1X legyen. A DTT végső koncentrációja 0,1 M legyen.

	Redukált	Nem redukált
Minta	6.5 - X µL	7.5 - X µL
DI víz	X µL		X µL	X µL
4X LDS puffer4X LDS puffer	2.5 µL	2.5 µL
1 M DTT	1 µL			N/A
Teljes térfogat	10 µL	10 µL

1. Melegítse a mintákat 10 percig 70 °C-on (ne forralja fel).
2. Töltse a mintákat és a fehérje standardot a mélyedésekbe.
3. Adjon azonos mennyiségű 1X betöltő puffert az üres mélyedésekbe.
4. A gélek 200 V-on futtathatók, amíg a festék vagy a fehérje standard el nem éri a gél végét, kb. 30-60 percig, a gél százalékos arányától függően.

mPAGE^® TurboMix Bis-Tris gélek MOPS és MES futópufferrel

mPAGE^® TurboMix Bis-Tris gélek kizárólag MOPS vagy MES futópufferrel való működésre tervezték. Attól függően, hogy melyik futópuffert használjuk, nagyon eltérő elválasztási mintázat érhető el. A MOPS puffer a nagy és közepes méretű fehérjék elválasztásának finomhangolására használható, míg a MES puffer a kisebb fehérjék optimális elválasztását biztosítja. A migrációs táblázatok (2. ábra) segítségével meghatározható, hogy melyik gélfutó pufferrendszer a legmegfelelőbb a tervezett elválasztási tartományhoz.

2. ábra. Migrációs diagramok 8%-os, 10%-os, 12%-os és 15%-os mPAGE^® TurboMix Bis-Tris gélekhez MOPS és MES SDS futópufferrel.