Hogyan futtassunk mPAGE™ fehérje gélt a Bio-Rad elektroforézis rendszerrel?

1. Készítse elő a futópuffert
2. Készítse elő a fehérje gélt
3. Elektroforéziskamra összeállítása
/li>
4. Minták előkészítése és betöltése
5. Gél lefuttatása
6. Gél eltávolítása a kazettából

*Ez a protokoll a Bio-Rad Mini-PROTEAN^® Tetra, Mini-PROTEAN II^® és Mini-PROTEAN^® 3 elektroforézis rendszerekhez alkalmazható.

Tippek és GYIK

• A Bio-Rad elektroforéziskamra összeszerelése mPAGE™ gélekkel
• MES kontra MES kiválasztása. MOPS futópuffer kiválasztása fehérje gélelektroforézishez
• Minta előkészítése és betöltése
/li>
• Hogyan futtassunk egy gélt
• A fehérje gél eltávolítása
• A fehérje gél eltávolítása
/a>

A Bio-Rad elektroforéziskamra összeállítása az mPAGE™ segítségével Gélek

1. Fordítsa vissza a Bio-Rad futómodul tömítéseit a standard beállításból (1.-2. ábra). Ha ez a lépés kimarad, a puffermag a külső kamrába szivárog.
2. Az mPAGE™ gélt úgy helyezze be, hogy a rövidebb lemez a kamra belső magja felé nézzen.

1. ábra. A Bio-Rad elektroforézis egységben lévő gumitömítést az mPAGE™ gél elhelyezése előtt meg kell fordítani.

2. ábra. Balra: A Bio-Rad tömítés helytelen orientációja az mPAGE™ gélekkel való használathoz. Jobbra: A Bio-Rad tömítés helyes orientációja az mPAGE™ gélekkel való használathoz.

MES vs. MOPS futópuffer kiválasztása fehérje gélelektroforézishez

Kétféle puffer használható futópufferként az SDS-PAGE gélekhez: MES és MOPS. A MES-nek alacsonyabb a pKa értéke, mint a MOPS-nak, ami lehetővé teszi a gél gyorsabb lefutását. A MES pufferrel jobban elválaszthatók az alacsonyabb molekulatömegű fehérjék, míg a MOPS pufferrel a nagyobb molekulatömegű fehérjék (3. ábra).

• A MES futópuffert a kis molekulatömegű fehérjék felbontásához használja
• A MOPS futópuffert a közepes és nagy molekulatömegű fehérjék felbontásához használja

3. ábra. A MES (bal oldali kép) vs. MOPS (jobb oldali kép) futópuffer kiválasztása mPAGE™ fehérje gélelektroforézishez a fehérje mérete és az akrilamid gél százalékos aránya alapján. A megfelelő sávok fehérjemérete kDa-ban feltüntetve. A kisebb fehérjéket hatékonyabban oldja fel a MES futópuffer; a nagyobb fehérjéket hatékonyabban oldja fel a MOPS futópuffer.

Minta előkészítése és betöltése

1. A mintákat közvetlenül az elektroforézis előtt készítse elő az 1. táblázatban megadottak szerint.

.

1. táblázat.

Reagens	Redukált minta (µL)	<.th>Nem redukált minta (µL)
Proteinminta	x	x
x
mPAGE™ 4X mintapuffer	2.5	2.5
1 M DTT1	1
Deionizált víz	6.5 - x	7.5 - x
Teljes térfogat	10	10

2. A mintákat 10 percig melegítse 70 °C-on (ne forralja fel a mintákat). A minták betöltése előtt rövid ideig centrifugálja a mintákat.
3. A mintáknak a mélyedésekbe történő betöltéséhez a pipettahegyet függőlegesen helyezze be a minta optimális betöltésének érdekében (4. ábra). A minták betöltésekor ne lépje túl a kutak kapacitását: 80 μL a 10 lyukú gélekhez; 60 μL a 12 lyukú gélekhez; és 40 μL a 15 lyukú gélekhez.

4. ábra. Helytelen és megfelelő pipettázási szög a minták mPAGE™ előregyártott gélekbe történő betöltéséhez.

Hogyan futtasson egy gélt

1. Amint a minták betöltése és a pufferkamrák feltöltése után helyezze a fedelet az elektroforézis tartályra, és csatlakoztassa az elektromos vezetékeket a tápegységhez.
2. Futtassa a gélt állandó feszültségen, amíg a festékfront el nem éri a gélkazetta aljától 2 mm-re. A futási idő a gél százalékos arányától, a futópuffertől és a használt berendezéstől függően változhat. A kiválasztott gélhez és futópufferhez legjobban illeszkedő optimális feszültséget és tipikus futási időt lásd a 2. táblázatban. Ha elektroforézis tartályonként egynél több gélt futtat, az összes gélnek azonos összetételűnek kell lennie.

2. táblázat.

% akrilamid	mPAGE™ MES SDS futópuffer 180 V	mPAGE™ MOPS SDS futópuffer 200 V
Típusos áramerősség (indítás - befejezés)	Típusos futási idő	Típusos áramerősség (indítás - befejezés)	Típusos futási idő
8%	109-55 mA	22 perc	103-47 mA	27 perc
10%	105-50 mA	26 min	97-48 mA	31 perc
100-46 mA	30 perc	/td>	97-42 mA	34 perc
4-12%	107-53 mA	26 perc	36 perc
4-20%	106-44 mA	40 perc	34 perc
8-16%	113-48 mA	32 perc	31 perc

A fehérjegél eltávolítása

1. Kapcsolja ki a tápellátást, vegye le a fedelet az elektroforézis egységről, és vegye ki a gélt.
2. A géllemezek fellazításához használja az mPAGE™ gélkazetta nyitószerkezetet (5. ábra). A Gel Cassette Opener a gélt körülvevő két műanyag géllemez közé helyezhető, és karként használható a lemezek szétválasztásához. Ne feledje, hogy a gél mindkét oldalán lévő géllemezeket a kazettanyitóval lazítsa meg.

5. ábra.

3. Tartsa a gélt vízszintesen, és óvatosan emelje le a felső lemezről.
4. Lassan húzza le a gélt az alsó lemezről, és helyezze pufferbe vagy desztillált vízbe a festéshez vagy blottoláshoz.