Northern & Southern Blot protokollok

Southern Blotting protokoll
Northern Blotting protokoll

Mi az északi és a déli blotting?

A makromolekulák, például a nukleinsavak és a fehérjék szilárd fázisú membránhordozóra történő átvitelét nevezzük blottingnak. A gélelektroforézissel elválasztott DNS- és RNS-molekulák töredékeit nejlon- vagy nitrocellulózmembránra viszik át a Southern és Northern blottingnak nevezett eljárás során. A Southern blottingot Edwin Southern vezette be 1975-ben, mint a DNS-mintákban található specifikus DNS-szekvenciák kimutatására szolgáló módszert. Az ebből a módszerből kialakult egyéb blotting technikákat Northern (RNS-re), Western (fehérjékre), Eastern (poszttranszlációs fehérjemódosításokra) és Southwestern (DNS-fehérje kölcsönhatásokra) blottingnak nevezték el.

A Southern és Northern blotting protokollok a következő főbb lépéseket tartalmazzák:

• DNS/RNS tisztítása: A DNS/RNS extrahálása és tisztítása sejtekből vagy szöveti forrásokból.
• A DNS emésztése: A DNS-t restrikciós enzimekkel töredékekre emésztjük. Ez a lépés az RNS esetében nem szükséges.
• Gélelektroforézis: A DNS-fragmentumok szétválasztása agarózgélen. Az RNS-mintákat agarózgélen lehet elválasztani formaldehiddel mint denaturáló szerrel, amely korlátozza az RNS-molekulák másodlagos szerkezetét.
• Transzfer: A DNS/RNS-fragmentumokat a gélről nejlonmembránra kell átvinni.
• >előhibridizáció (blokkolás): Mossuk a nejlonmembránt egy lazacspermium DNS-t tartalmazó előhibridizációs oldattal a nem specifikus DNS kölcsönhatások blokkolása és a háttérzaj csökkentése érdekében. Alternatív megoldásként használhatja a PerfectHyb™ Plus puffert, amely nem igényel lazac spermium DNS-t a blokkoláshoz.
• Szonda előkészítése: Készítsen friss szonda DNS-t, és jelölje meg ³²P alfa-jelölt dCTP-vel.
• Hibridizáció: Inkubálja a blotot a jelölt szondával.
• A szonda kimutatása: A szonda és a kívánt DNS/RNS-szekvencia kimutatása -80 °C-on filmre exponálással.

1. ábra. A DNS/RNS blotting eljárás lépései

Southern Blotting protokoll

Szükséges anyagok

• Reagensek a DNS izoláláshoz és tisztításhoz
  
• Reagensek a DNS restrikciós emésztéséhez
  
• Reagensek és pufferek az agaróz gélelektroforézishez
  
• Az agaróz gélelektroforézishez szükséges eszközök
  
• Whatman szűrőpapírok
  
• Papírtörlő
  
• Pozitív töltésű nejlonmembrán
  
• Lalomspermium DNS
  
• Hibridizációs cső
  
• Röntgenfilmek
  
  

Szükséges pufferek

• 10X TBE (93290), amelyet a gélelektroforézis során használunk. TAE puffer (65497) használható a TBE helyett nagyobb DNS-fragmentumok esetén. Alternatív megoldásként a TAE vagy a TBE helyett használjon Bionic™ puffert (B6185), hogy rövidebb idő alatt élesebb sávokat kapjon. A 10X TBE puffert a következő reagensekkel készítheti el:
  
  TRIS 1.3 M
  Bórsav 450 mM
  EDTA 25 mM
  
  
  
• 20X SSPE (S2015), amelyet prehibridizáció előtti és transzfer pufferként használunk. Hasonló blotting protokollokban az SSPE helyett 20X SSC (93017) használható. Alternatívaként a 20X SSPE oldatot a következő reagensekkel is elkészítheti:
  
  NaCl 2,98 M
  EDTA 0,02 M
  Foszfát puffer (pH 7,4) 0.2 M
  
  
  
• Denaturáló oldat (N1531), amelyet a dsDNS denaturálására használunk, hogy hozzáférhetővé tegyük a szonda számára. Alternatívaként az 1X denaturáló oldatot a következő reagensekkel is elkészítheti:
  
  NaCl 1,5 M
  NaOH (S5881) 0.5 N
  Állítsuk be a pH-t ~13-ra
  
  
• Neutralizáló oldat (N6019), amelyet a gél semlegesítésére használunk a dsDNS denaturálása után. Alternatívaként az 1X semlegesítő oldatot a következő reagensekkel is elkészítheti:
  
  NaCl 1,5 M
  TRIS HCl 1 M
  Állítsa be a pH-t 7-re.5
  
  
  
• *Denhardt-oldat (D2532), amelyet az előhibridizáció során a nem specifikus DNS-hibridizáció blokkolására használunk. Alternatívaként az 50X Denhardt-oldatot a következő reagensekkel is elkészítheti:
  
  Szarvasmarha szérum albumin (A7906) 1%
  Ficoll (F2637)./a>) 1%
  Polyvinilpirrolidon (PVP40) 1%
  
  Oldjuk fel a komponenseket vízben 50 ml végső térfogatra. Szűréssel sterilizáljuk.
• *2X Prehybridizációs oldat (P1415), amelyet a membrán előkészítéséhez használunk a szondahibridizációhoz. Alternatívaként elkészítheti az 1X prehibridizációs oldatot (100 ml) a következő reagensekkel:
  
  20X SSPE 30 mL
  100X Denhardt-oldat 10 mL
  10% SDS 10 mL
  Víz 50 mL
  
  
  
• *Hibridizációs oldat (H7140), amelyet a hibridizációs lépés során használunk. Alternatívaként elkészítheti a hibridizációs oldatot (100 mL) a következő reagensekkel:
  
  
  20X SSPE 30 mL
  10% SDS 10 mL
  Víz 60 mL
  
  
  
• 1X szondapuffer, amelyet a szondakeveréshez használ. (100 µL; frissen készítsük):
  
  1 M TRIS, pH 7,6 50 µL
  2 M MgCl₂ 5 µL
  0.5 M DTT 10 µL
  Víz 35 µL
  
  
  
• 1X szondakeverék (27 µL):
  
  Szondapuffer 2,7 µL
  Oligonukleotid szonda (0.2 µg/µL) 2 µL
  T4 foszfonukleotid-kináz (PNK) 1 µL
  Víz 11.3 µL
  ³²P-ATP 10 µL
  
  
  
• 6X Alacsony szigorú mosóoldat, az alacsony homológiájú hibridizáció eltávolítására és a háttérzaj csökkentésére szolgál. Készítsen 600 mL mosóoldatot a következő reagensek felhasználásával:
  
  
  20X SSPE 180 mL
  10% SDS 12 mL
  Víz 408 mL
  
  
  
• 1X Nagy feszességű mosóoldat, amelyet a szorosan homológ hibridizáció eltávolítására és a háttérzaj további csökkentésére használnak. Készítsen 600 ml mosóoldatot a következő reagensek felhasználásával:
  
  20X SSPE 30 mL
  10% SDS 12 mL
  Víz 558 mL

*PerfectHyb™. Plus hibridizációs puffer (H7033) használható a Denhardt, a prehibridizációs és a hibridizációs oldatok helyett. A PerfectHyb™ puffert úgy optimalizálták, hogy 1-2 órás hibridizáció esetén is maximális jelet adjon minimális háttérrel. A PerfectHyb™ Plus-t úgy alakították ki, hogy bármilyen hibridizációs protokollban, bármilyen típusú szondát használva és bármilyen típusú membránon (pozitívan töltött vagy semleges nejlon és nitrocellulóz) működjön. 

DNS izolálása

A Sigma-Aldrich GenElute™ készleteket kínál a növényekből és gombákból származó DNS izolálásához (

Megfelelő DNS-izolálási készletek

).a href="/product/sigma/E5038">E5038), emlős sejtekből vagy szövetekből (G1N70, G1N10 és G1N350 G1N350.) és vér (NA2010 és NA2020). A GenElute™ kitek használatával történő DNS-izolálás részletes protokollja megtalálható itt.

Kiegészítésképpen a DNAstable^® kitek (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML és 93121-017-1EA) használható a DNS szállítása esetén, illetve a DNS szobahőmérsékleten történő tárolására és stabilizálására.

Resztrikciós emésztés

A DNS-mintát a megfelelő restrikciós enzimmel 2-24 órán keresztül 37 °C-on eméssze. Ha a DNS-minta klónokból származik, elegendő 1-2 óra emésztési idő. Genomi DNS esetén általában egy éjszakán át tartó inkubáció szükséges, többlet enzimmel (5-10X).

Szükség esetén az emésztett DNS-t etanolos kicsapással koncentráljuk. Az etanol nyomait teljesen el kell távolítani a gélen történő elválasztás előtt.

Gélelektroforézis

Az emésztett DNS-t agarózgélen oldjuk fel. Rövidebb futásokhoz (<4 óra) és nagyobb DNS-fragmentumokhoz TAE-t, míg hosszabb futásokhoz (<4 óra) és kisebb DNS-fragmentumokhoz (<1 kb) TBE-t kell használni. Alternatívaként használjon Bionic™ puffert  (B6185) a TAE-nél vagy a TBE-nél rövidebb idő alatt élesebb sávfelbontáshoz (további információért lásd Bionic™ puffer adatok). Fesse meg a gélt etídium-bromiddal, és készítsen gélképet UV-transzilluminátorral. Ha az etídium-bromidot az elektroforézis előtt beépítették az agarózba, a gélképet közvetlenül a futtatás után lehet felvenni.

Transzfer

A transzfer lépés során a DNS-t (vagy RNS-t) az elektroforézis gélről egy nejlonmembránra kell átvinni, hogy a hibridizáció és a detektálás céljából egy szonda számára hozzáférhető legyen.

• A gélt egy olyan tálcába kell átvinni, amely annyi denaturáló oldatot tartalmaz, hogy a gélt teljesen befedje. Mossuk a gélt kétszer ezzel az oldattal, mindegyik mosás 25 percig tart rázógépen.
  
• Öblítsük át a gélt kétszer vízzel.
  
• Mossuk át a gélt kétszer semlegesítő oldattal, mindegyik mosás 15 percig tart rázógépen.
  
• Öblítsük át a gélt kétszer vízzel.
  
• Mossa a gélt 20X SSPE-vel 30 percig rázógépen.
  
• A fenti lépés során készítse elő a Whatman-papírt és a membránt a transzfereljáráshoz.
  
• Vágjon le egy csíkot a nejlonmembránból (15356), és áztassa be vízbe. Vágjon egy, a gélnél szélesebb csíkot a Whatman papírból, és áztassa 10X SSPE pufferben (transzferpuffer).
  
• Vágjon három, a gél méretével közel azonos méretű csíkot a Whatman papírból.
  
• Vágjon több, a gél méretével majdnem azonos méretű papírtörlőt.
  
• Tegyen egy stabil platformot egy 10X SSPE-t tartalmazó tálcára.
  
• Tegyen egy szarufóliát a platformra. Helyezzen egy 10X SSPE-vel átitatott Whatman-papírt a szarufóliára. Győződjön meg arról, hogy nincsenek légbuborékok beszorulva, görgesse le őket egy üvegpálca segítségével. Győződjön meg arról, hogy a Whatman-papír szélei érintkeznek a tálcán lévő SSPE-pufferrel. Ez a Whatman-papírdarab kanócként fog működni, hogy az SSPE-puffert felfelé és a gélen keresztül húzza, és a DNS-csíkokat a nejlonmembránra helyezi.
  
• Tegye a gélt, arccal lefelé a nedves Whatman-papírra. Helyezze a membránt a gél tetejére. Győződjön meg arról, hogy nem rekedtek légbuborékok, és görgesse le őket egy üvegpálcika segítségével.
  
• Tegyen három csík Whatman-papírt a membránra. Győződjön meg róla, hogy nem rekedtek légbuborékok, görgesse le őket egy üvegpálca segítségével.
  
• Tegyen erre egy köteg papírtörlőt, majd helyezzen rá súlyt (például üveglapot).
  
• A DNS-fragmentumok teljes átviteléhez hagyja állni ezt az összeállítást egy éjszakán át. A 15 kb-ig terjedő DNS-fragmentumok átvitele körülbelül 18 órát vesz igénybe.
  
• A transzfer befejezése után helyezze a blotot automatikus beállítású UV-kereszthivatkozóba. Az UV-keresztkötés a DNS vagy az RNS kovalensen kötődik a nejlonmembránhoz, ami növeli a hibridizációs jeleket a kimutatás során. Egy másik lehetőség a száraz membrán sütése a transzfer után, ami a nukleinsavak nem kovalens, de félig állandó kötését eredményezi a membránhoz. A DNS-t nem lehet UV-keresztkötéssel a nitrocellulózmembránhoz kötni, ezért azt ki kell sütni.

2. ábra. Southern/northern blot transzfer összeszerelése

Előhibridizáció (blokkolás)

A prehibridizációs lépés (más néven blokkolás) a szonda nem specifikus kötődésének minimalizálása érdekében történik a nejlonmembránhoz. A lazacspermium DNS-t általában blokkolószerként használják, hogy megakadályozzák a szonda tapadását a membránhoz, biztosítva, hogy csak a membránra átvitt, kívánt DNS-sávokkal lépjen kölcsönhatásba. Készítse el az előhibridizációs oldatot az alábbiak szerint, vagy használja a PerfectHyb™ Plus puffert (H7033):

• Melegítse fel az előhibridizációs oldatot 42 °C-ra.
  
• Melegítsen egy mintát lazac spermium DNS-ből (D9156) 95 °C-ra 5 percig, majd azonnal hűtse jégen.
  
• Adjon lazac spermium DNS-t a meleg prehibridizációs oldathoz úgy, hogy a DNS végső koncentrációja 50 µg/ml legyen.
  
• Vegye ki a blotot az UV-keresztkötőből, és óvatosan tekerje egy hibridizációs csőbe.
  
• Adjon előhibridizációs oldatot a spermium DNS-sel a hibridizációs csőbe, és helyezze 42 °C-on a hibridizációs kemencébe 5 órára.

Hibridizáció

Egy komplementer DNS-szálat (szondát) használunk a kívánt szekvencia kimutatására, amelynek jelen kell lennie a membránon. Két különböző forrásból származó DNS kombinációjával "hibrid" dsDNS-t hoz létre, de csak akkor, ha a két szál homológ.

• Készítsen 1X szondakeveréket, és inkubálja vízfürdőben 37 °C-on 40 percig.
  
• A szabad jelölés (nem beépített szonda) eltávolítható a szondakeverék G-25 Sephadex oszlopon történő átvezetésével.
  
• Határozza meg a szonda specifikus aktivitását folyékony szcintillációval.
  
• Melegítsen fel 10 ml hibridizációs oldatot 49 °C-ra, adjon hozzá 10-15 X 10⁶ cpm szondát, és jól keverje össze.
  
• Dobja ki a blotból az előhibridizációs oldatot; adja hozzá a hibridizációs oldatot a jelölt szondával. Inkubáljon egy éjszakán át 49 °C-on.
  Megjegyzés: Alternatív megoldásként használjon PerfectHyb™ Plus puffert (H7033) a sokkal rövidebb ideig tartó, erősebb jelhozamú hibridizációhoz. További protokollinformációk és adatokért lásd PerfectHyb™ Plus protokoll.
  
• Melegítse a 6X mosóoldatot 49 °C-ra. Dobja ki a hibridizációs oldatot a blotból, és adjon hozzá 6X mosóoldatot.
  
• A 6X alacsony szűkületű mosóoldatot melegítse 49oC-ra. Dobja ki a hibridizációs oldatot a blotból, és adja hozzá a 6X mosóoldatot. Az alacsony szigorítású mosás eltávolítja az alacsony homológiájú hibridizációkat, hogy a magas homológiájú kölcsönhatásokat hátrahagyva finomítsa a kívánt DNS-mintát.
  
• Készítse el az 1X magas szigorítású mosóoldatot, és melegítse 49oC-ra. Mossa a blotot körülbelül 30 másodpercig, és dobja el a mosóoldatot. Ebben a lépésben a nagyszorítós oldat a kívánt DNS további finomítására szolgál a szorosan homológ hibridizációk eltávolításával.
  
• A blot aktivitását Geiger-számlálóval ellenőrizze. Kívánatosak a 10-50 számlálás/másodperc értékek a besugárzási csúcsok sávjaival. Ha a háttér túl magas, mossa át újra a blotot 1X mosóoldattal.

A szonda kimutatása

• Tegye a blotot egy új szarufóliával bélelt filmkazettába, és óvatosan tekerje be a blotot, ügyelve arra, hogy a blot és a fólia között ne maradjanak légbuborékok.
  
• Vigyük a kazettát a sötétkamrába, és helyezzük a röntgenfilmet a foltra. Zárja le a kazettát, és helyezze -80 °C-ra egy éjszakára. Másnap fejlessze a filmet.
  
• Egy másik röntgenfilmlapot is rá lehet helyezni a foltra, és egy újabb expozícióhoz visszatenni a -80 °C-os hőmérsékletre.

Northern Blotting protokoll

A Northern blotting protokollja hasonló a Southern blottingéhoz. Az RNS-szekvenciákat azonban formaldehiddel bevont denaturáló agaróz gélen választjuk el.

RNS-izolálás

• Az RNS-t sejtekből vagy szövetmintákból a TRI Reagens segítségével izolálja
  .sup>®  (T9424) vagy a GenElute™ segítségével. kit emlős sejtekhez vagy szövetekhez (RTN70, RTN10 és RTN350).
  
• Az RNS minőségének és koncentrációjának meghatározásához olvassa le a minták abszorbanciáját 260 nm-en és 280 nm-en. Az abszorbancia A₂₆₀/A₂₈₀ 1,8-2,1 közötti aránya jó minőségű RNS-t jelez.

Gélelektroforézis

• A mintákat pipetták segítségével óvatosan töltse a mélyedésekbe. Szükség esetén megfelelő, különböző méretű RNS-fragmentumokat tartalmazó marker (R7020, R7644) is betölthető.
  
• Az RNS agaróz gélelektroforézisben történő denaturálására vonatkozó részletes protokollt lásd a Elvezetés a nukleinsav-elektroforézishez
  

Ha az elektroforézis előtt etídium-bromidot építettek be az agarózba, a gélkép közvetlenül a futtatás után elkészíthető.

Transzfer

A transzfer beállítása, az előhibridizáció, a hibridizáció és a detektálás protokolljai megegyeznek a Southern blotting protokolljaival.

Hivatkozás

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold spring harbor laboratory press.