Hogyan kell mPAGE™ fehérje gélt futtatni az Invitrogen XCell Surelock^® Mini-Cell elektroforézis rendszerrel?

1. Készítse elő a futópuffert
2. Készítse elő a fehérje gélt
3. Elektroforéziskamra összeállítása
/li>
4. Minták előkészítése és betöltése
5. Gél lefuttatása
6. Gél eltávolítása a kazettából

Tippek és GYIK

• Az Invitrogen (Thermo) XCell I, XCell II vagy XCell Surelock™ Mini-Cell Electrophoresis Chamber for mPAGE™ Gels összeszerelése
• A MES vs. MOPS futópuffer kiválasztása fehérje gélelektroforézishez
• Minta előkészítése és betöltése
• A gél futtatása
• A fehérje gél eltávolítása

Invitrogen (Thermo) XCell I, XCell II vagy XCell Surelock™ Mini-Cell elektroforéziskamra összeállítása mPAGE™ gélekhez

Az XCell mini-cellák az mPAGE™ gélekkel az mPAGE™ adapterlemezek használatával kompatibilisek. Gélenként egy Adapter Plate-et használjon. A géltartály összeszerelése előtt helyezze az adapterlemezt a gélkazetta magas lemezéhez (1. ábra).

1. ábra. Az mPAGE™ adapterlemez és az mPAGE™ gél használata fehérjeelektroforézishez.

MES vs. MOPS futópuffer kiválasztása fehérje gélelektroforézishez

Kétféle puffer használható futópufferként az SDS-PAGE gélekhez: MES és MOPS. A MES-nek alacsonyabb a pKa értéke, mint a MOPS-nak, ami lehetővé teszi a gél gyorsabb lefutását. A MES pufferrel jobban elválaszthatók az alacsonyabb molekulatömegű fehérjék, míg a MOPS pufferrel a nagyobb molekulatömegű fehérjék (2. ábra).

• A MES futópuffert a kis molekulatömegű fehérjék felbontásához használja
• A MOPS futópuffert a közepes és nagy molekulatömegű fehérjék felbontásához használja

2. ábra. A MES (bal oldali kép) vs. MOPS (jobb oldali kép) futópuffer kiválasztása mPAGE™ fehérje gélelektroforézishez a fehérje mérete és az akrilamid gél százalékos aránya alapján. A megfelelő sávok fehérjemérete kDa-ban feltüntetve. A kisebb fehérjéket hatékonyabban oldja fel a MES futópuffer; a nagyobb fehérjéket hatékonyabban oldja fel a MOPS futópuffer.

Minta előkészítése és betöltése

1. A mintákat közvetlenül az elektroforézis előtt készítse elő az 1. táblázatban megadottak szerint.
   

¹DDT vagy β-merkaptoetanol (BME) használható redukálószerként (DTT 100 mM végkoncentrációig vagy BME hozzáadása 25 mM végkoncentrációig).

Reagens	Redukált minta (µL)	<.th>Nem redukált minta (µL)
Proteinminta	x	x
x
mPAGE™ 4X mintapuffer	2.5	2.5
1 M DTT1	1
Deionizált víz	6.5 - x	7.5 - x
Teljes térfogat	10	10

2. A mintákat 10 percig melegítse 70 °C-on (ne forralja fel a mintákat). A minták betöltése előtt rövid ideig centrifugálja a mintákat.
3. A mintáknak a mélyedésekbe való betöltéséhez a pipettahegyet függőlegesen helyezze be az optimális mintatöltési eredmény érdekében (3. ábra). A minták betöltésekor ne lépje túl a kutak kapacitását: 80 μL a 10 lyukú gélekhez; 60 μL a 12 lyukú gélekhez; és 40 μL a 15 lyukú gélekhez.

3. ábra. Helytelen és megfelelő pipettázási szög a minták mPAGE™ előregyártott gélekbe töltéséhez.

Hogyan futtassa a gélt

1. Amint a minták betöltése és a pufferkamrák feltöltése után helyezze a fedelet az elektroforézis tartályra, és csatlakoztassa az elektromos vezetékeket a tápegységhez.
2. Futtassa a gélt állandó feszültségen, amíg a festékfront eléri a gélkazetta aljától számított 2 mm távolságot. A futási idő a gél százalékos arányától, a futópuffertől és a használt berendezéstől függően változhat. A kiválasztott gélhez és futópufferhez legjobban illeszkedő optimális feszültséget és tipikus futási időt lásd a 2. táblázatban. Ha elektroforézis tartályonként egynél több gélt futtat, az összes gélnek azonos összetételűnek kell lennie.

4. ábra. Használja az mPAGE™ gélkazettanyitó kart a géllemezek eltávolításához.

3. Tartsa vízszintesen a gélkazettát, és óvatosan emelje le a felső lemezt.
4. Lassan húzza le a gélt az alsó lemezről, és helyezze pufferbe vagy desztillált vízbe a festéshez vagy blottoláshoz.