Standard PCR protokoll

Hogyan kell elvégezni a PCR-t

A standard polimeráz láncreakció (PCR) beállítása négy lépésből áll:

1. Adja hozzá a szükséges reagenseket vagy mastermixet és a templátot a PCR-csövekhez.
2. Keverje össze és centrifugálja.
   *Adjunk hozzá ásványi olajat a párolgás megakadályozására a fűtött fedél nélküli termociklálóban.
3. A termocikláló és a primer paraméterei szerint amplifikáljunk.
4. Az amplifikált DNS-t agaróz gélelektroforézissel, majd etídium-bromid festéssel értékeljük.

Ezeket a lépéseket az alábbiakban részletesebben bemutatjuk, valamint az anyagok és a reagensek kiválasztására vonatkozó tippeket. Ez egy alapvető PCR protokoll Taq DNS-polimeráz használatával.

PCR-lépések és alapvető PCR-összetevők

A PCR-reakció hibaelhárítása számos tényezőt foglal magában. Nézze meg ezt az animációt, hogy megtudja, hogyan segíthet az optimális eredmények elérésében a megfelelő komponensek és cikluskörülmények kiválasztása.

A PCR-technológiák útmutatójának Protokollok részében további protokollokat talál más polimerázokhoz vagy fejlett PCR-technikákhoz.

Tudjon meg többet a standard PCR-ről, többek között arról, hogy mi is az, a PCR alapjai oldal.

Reagensek: Mi szükséges a PCR-hez?

A PCR-ben használt reagens	Az ajánlott termék
Taq DNS-polimeráz	Válassza Taq DNS-polimerázt a felhasználó preferenciái alapján. (Lásd a külön Taq polimeráz táblázatot alább.)
PCR minőségű víz	PCR reagens víz
Munkakoncentrációra hígított primerek	A legtöbb vizsgálathoz elegendő a 10 µM-os munkakészlet.
Oligók	Egyedi oligók
Az amplifikálandó DNS		A kutató által biztosított
Dedikált pipetták
Thermikus cikláló	Különböző méretű lyukblokkokkal vagy multiformátumban
Szteril szűrő pipettahegyek
Szteril 1.5 ml-es csavaros tetejű mikrocentrifugacsövek	Corning® mikrocentrifugacsövek csavaros kupakkal
PCR csövek vagy lemezek	Válassza ki a cikclerhez való illeszkedést:
	Egyedi vékonyfalú 200 µl-es PCR-csövek
200 µl-es csíkcsövek
Multiwell lemezek és lemezzárólemezek
dNTP mix		Deoxinukleotid mix 10 mM dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t tartalmaz *areadymixek már tartalmaznak dNTP-ket

Mi az Taq polimeráz?

A Taq DNS-polimeráz a termofil baktériumból Thermus aquaticusból származó termosztatikus enzim. Ezt általában a DNS-töredékek PCR-ben történő felerősítésére használják. Az enzim rekombináns formában, E. coliban expresszálódik. Képes az ismételt 95 °C-ra történő melegítést (ahogyan azt a PCR-technika megköveteli) jelentős aktivitásvesztés nélkül elviselni. Az enzim molekulatömege SDS-PAGE szerint körülbelül 94 kDa, endonukleáz vagy exonukleáz aktivitás nem mutatható ki. 5'→3' DNS-polimeráz aktivitással és 5'→3' exonukleáz aktivitással rendelkezik. A Taq DNS-polimeráz minden egyes tételét PCR-amplifikációra és kettősszálú szekvenálásra tesztelik. Az enzimet 5 egység/µL mennyiségben szállítjuk, és optimalizált 10x reakciópufferrel szállítjuk.

Standard Taq Taq DNS-polimeráz

Az alábbi táblázat segítségével kiválaszthatja a reakciókörülményeknek megfelelő Taq DNS-polimeráz keveréket. Válasszon a tiszta vagy vörösre festett formulák közül magnézium-kloriddal (MgCl₂) és anélkül, vagy előre elkészített readymix vagy master mix pufferrel és dNTP-kkel.

MgCl-tartalmú2		Szeparált MgCl2	Readymix                                  .nbsp;
Tiszta formuláció festék nélkül		Vörös festékkel a gélek közvetlen betöltéséhez		Tiszta formuláció festék nélkül	Vörös festékkel a gélek közvetlen betöltéséhez	Tiszta formuláció festék nélkül
Taq DNS-polimeráz a DNS-polimerázból Thermus aquaticus (D1806)		REDTaq® DNS-polimeráz (D4309)		REDTaq® DNS polimeráz (D4309)	Taq DNS polimeráz a Thermus aquaticus-ból, MgCl2 nélkül (D4545)	REDTaq® ReadyMix™ PCR-reakció-keverék (R2523)	ReadyMix™ Taq PCR-reakció-keverék (P4600)

Egység meghatározása: Egy egység 30 perc alatt, 74 °C-on 10 nmol összes dezoxiribonukleozid-trifoszfátot épít be savval kicsapható DNS-be.

Eljárás: A PCR lépései

Az Taq DNS-polimeráz, a templát-DNS, a primerek és a MgCl₂ koncentrációjának optimális körülményei az alkalmazott rendszertől függnek. Szükség lehet az egyes komponensek optimális körülményeinek meghatározására. Ez különösen igaz a Taq DNS-polimerázra, a ciklikus paraméterekre és a MgCl₂ koncentrációjára. Javasoljuk, hogy az enzimet és a MgCl₂-t titráljuk az optimális hatékonyság meghatározásához.

1. A reagenseket a táblázatban megadott sorrendben adjuk egy megfelelő méretű csőbe. (Válassza ki a megfelelő táblázatot a reakcióbeállításhoz: standard vagy readymix reagens.) Nagyszámú reakció esetén a sablon nélküli mastermixet kell beállítani és aliquotálni a reakciócsövekbe. A végén a sablont a megfelelő csövekbe kell adagolni.
   

Standard PCR-reakció

Amount	Component	végleges koncentráció
w µL	Víz
5 µl	10x PCR puffer (P2192 vagy P2317)*	1x
1 µL	Deoxinukleotid keverék	200 µM
w µL	Első primer (jellemzően 15-30 bázis hosszúságú)	0.1-0.5 µM
x µL	Reverse primer (jellemzően 15-30 bázis hosszúságú)	0.1-0,5 µM
0.5 µL	Taq DNS-polimeráz*	0.05 egység/µL
y µL	Minta DNS (jellemzően 10 ng)	200 pg/µL
z µL	25 mM MgCl2. (csak pufferrel használható P2317)	0.1-0.5 mM
50 µL	Teljes reakciótérfogat

*Vásároljon puffert és Taq polimerázt együtt: D1806, D4309 vagy D4545

Readymix PCR-reakció

.

Mennyiség	Komponens	Végső koncentráció
25 µL	Readymix (R2523 vagy P4600)
w µL	Első primer (jellemzően 15-30 bázis hosszúságú)	0.1-0.5 µM
x µL	Reverse primer (jellemzően 15-30 bázis hosszúságú)	0.1-0.5 µM
y µL	Minta-DNS (jellemzően 10 ng)	200 pg/µL
z µL	Víz
50 µl	Teljes reakciótérfogat

2. Keverje össze óvatosan vortexszel és rövid centrifugálással, hogy az összes komponens összegyűljön a cső aljára.

Megjegyzés: Adjon 50 µl ásványi olajat minden egyes cső tetejére a párolgás megakadályozására, ha fűtött fedél nélküli termociklert használ.

3. Amplifikálás. Az amplifikációs paraméterek a primerektől és a használt termikus ciklertől függően változnak. Szükség lehet a rendszer optimalizálására az egyes primerek, a templát és a termikus ciklert illetően.

Típusos ciklusparaméterek

25-30 ciklusnyi amplifikáció ajánlott.

PCR lépés	hőmérséklet °C	tartam
	Denature sablon	94 °C	1 perc
Annealizálás primerek	55 °C	2 perc
Hosszabbítás	72 °C<	3 perc

4. A felszaporított DNS-t agaróz gélelektroforézis és az azt követő etídium-bromid festés.

        Megjegyzés: Az ásványi olajos fedés eltávolítható egyszeri kloroformos extrakcióval (1:1), a vizes fázis visszanyerésével.

Reagensek nukleinsav-elektroforézishez

• Agaróz  (előregyártott gélek, por stb.)
• Puffer mint például MOPS-EDTA-nátrium-acetát, tris-acetát-EDTA (TAE) vagy tris-borát-EDTA (TBE)
• Gél betöltő oldat és minta betöltő puffer az RNS-hez
• Elektroforézis festék vagy festék mint például etídium-bromid

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

A címke licencnyilatkozata

FIGYELMEZTETÉS A VÁSÁRLÓNAK:

A termék megvásárlásával semmilyen licenc nem kerül átadásra az US Patents No. 5,804,375, 5,994,056, 6,171,785, 6,214,979, 5,538,848, 5,723,591, 5,876,930, 6,030,787 és 6,258,569, valamint az Egyesült Államokon kívüli megfelelő szabadalmak, illetve az 5' nukleáz és dsDNS-kötő festék eljárásokra vonatkozó bármely más szabadalom vagy szabadalmi bejelentés alapján. További információért forduljon a Licensing Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA