Bevezetés az SDS-PAGE-ba - A fehérjék méret szerinti elválasztása

A poliakrilamid gélek akrilamid és bisz-akrilamid (N,N'-metilén-biszakrilamid) reakciójával jönnek létre, ami erősen térhálósodott gélmátrixot eredményez. A gél szitaként működik, amelyen keresztül a fehérjék az elektromos mező hatására mozognak. A fehérjék összességében pozitív vagy negatív töltést tartalmaznak; ez lehetővé teszi a fehérjemolekula mozgását az izoelektromos pont felé, ahol a molekulának nincs nettó töltése. A fehérjék denaturálásával és egységes negatív töltésükkel lehetővé válik a fehérjék méretük alapján történő szétválasztása a pozitív elektród felé történő vándorlásuk során.

1. ábra. SDS-PAGE fehérjeminták és color burst fehérjemarker(C1992)

Protokoll

Szükséges anyagok és reagensek

• Vertikális elektroforéziskamra tápegységgel, üveglemezekkel, távtartókkal és fésűkkel

Szükséges reagensek	A reagensben található összetevők	Akrilamid  29.2 g Bisz-akrilamid 0.8 g	01696 Acisz-acisz-acirid
Gélöntő pufferek	1.5 M Tris-HCl, pH 8,8 (a reszolváló gél elkészítéséhez): Oldjunk fel 18.15 g Tris-bázist 80 mL desztillált vízben. A pH-t 6N HCl segítségével állítsuk be 8,8-ra. A végső térfogatot desztillált vízzel töltsük fel 100 mL-re. 0,5 M Tris-HCl, pH 6.8 (stacking gél készítéséhez): Oldjunk fel 6 g Tris bázist 80 mL desztillált vízben. Állítsuk be a pH-t 6,8-ra 6N HCl segítségével. Töltsük fel a végső térfogatot 100 mL-re desztillált vízzel.	93362
2X Laemmli betöltő  puffer	Bromofenol kék 0.004% 2-merkaptoetanol 10% Glicerin 20% SDS 4% Tris-HCl 0.125 M	B5525 M3148	G5516 L3771 93362
10X futópuffer	Tris-HCl 25 mM Glicin 200 mM SDS 0.1% (w/v)		93362 G8898 G8898./a> L3771
10% SDS	SDS	L3771
10% Ammónium-perszulfát	Ammónium-perszulfát	A3678
TEMED	Aztr.TEMED	T9281

MEGJEGYZÉS: Az akrilamid és a bisz-akrilamid neurotoxikus természetű. Minden lépést pormentes kesztyűben kell elvégezni.

Gél előkészítés

• Tisztítsa meg a gélöntőegység üveglapjait és távtartóit ionmentesített vízzel és etanollal.
• Az üveglapokat a távtartókkal együtt állítsa össze egy stabil, egyenletes felületen.
• Készítse el a reszolváló géloldatot a következő mennyiségek felhasználásával (10 ml-hez) a szükséges gél százalékos arányától függően.

Gél %	Víz (mL)	30%-os akrilamid (mL)	1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (mL)	10% SDS (µL)	10% APS (µL)	TEMED*(µL)
8%	4.6	2.6	2.6	100	100	10
10%	3.8	3.4	2.6	100	100	10
12%	3.2	4.0	2.6	100	100	10
15%	2.2	5.0	2.6	100	100	10
100	10
*A TEMED-nek kell az utolsó hozzáadott összetevőnek lennie

• Öntse a géloldatot a távtartókkal összeállított lemezekbe. Az egyenletes és vízszintes felbontású gélfelület fenntartása érdekében fedje le a felületet vízzel vagy izopropanollal (I9516).
  
• Hagyja a gélt szobahőmérsékleten kb. 20-30 percig szilárdulni.
  
• Készítse el az egymásra helyező géloldatot a következő mennyiségek felhasználásával (10 ml-hez):
  

Gél %	Víz (mL)	30% akrilamid (mL)	0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (mL)	10% SDS (µL)	10% APS (µL)	TEMED*(µL)
5%	5.86	1.34	2.6	100	100	10

*A TEMED-nek kell az utolsó hozzáadott összetevőnek lennie

• Távolítsa el a reszolváló gélen
• Adja hozzá az 5%-os stacking géloldatot, amíg az túlcsordul. Azonnal helyezze be a fésűt, ügyelve arra, hogy ne maradjanak légbuborékok a gélben vagy a lyukak közelében.
• Hagyja, hogy a gél szobahőmérsékleten kb. 20-30 percig szilárduljon.
  

Minta előkészítése

• Egy térfogatnyi fehérjemintához (sejt- vagy szövetlizátum) adjunk ugyanannyi térfogatnyi töltőpuffert.
  
• A fenti keveréket 95 °C-on 5 percig forraljuk. Centrifugáljuk 16000 xg-nél 5 percig.
  
• Ezek a minták -20 °C-on tárolhatók, vagy felhasználhatók a gélelektroforézis folytatásához.

Gélfestés

Coomassie Blue festés: A fehérje gélek Coomassie Brilliant Blue R-250-gyel történő festése gyakori eljárás az SDS-PAGE által felbontott fehérjék láthatóvá tételére. Rendkívül érzékeny és alkalmas a gélek hosszú távú tárolására.

Szükséges reagensek

• Gélfixáló oldat (500 ml)
  
  
        Methanol (M3641) 250 ml
             Glaciális ecetsav (695092) 50 mL
        Víz 200 ml
  
  
  
• Koomassie-oldat
  
  
        CBB R-250 (B6529) 0.1%
        Methanol (M3641) 40%
         &a>.nbsp;Glaciális ecetsav (695092) 10%
        A festékoldatot a Whatmann No. 1 szűrőpapírral.
  
  
  
• festékoldat
  
  
          Methanol ((M3641) 50 ml
        Glaciális ecetsav (#695092) 35 ml
  
  
  
• Gél tárolóoldat
  
          Glaciális ecetsav (695092) 25 ml
        Víz 475 ml

Eljárás

• Az elektroforézis után helyezze a gélt egy gélfixáló oldatot tartalmazó műanyag tálcába. Helyezze a tálcát egy ringatóasztalra, és rögzítse a fehérjéket 2 órán keresztül.
  
• Vegye ki a gélfixáló oldatot, és adjon hozzá Coomassie-oldatot.  Helyezze egy ringatóasztalra, és fesse meg a gélt 2-4 órán keresztül.
  
• A festési lépés után a gélt többször mossa át desztillált vízzel a felesleges festék eltávolításához.
  
• Adjon a gélhez festéktelenítő oldatot. Helyezze hintázóasztalra, és kb. 4 órán keresztül destainezze, amíg tiszta kék sávok nem válnak láthatóvá tiszta háttéren.
  
• A destainezés után a gélek tárolhatók géltároló oldatban, és szükség szerint fényképezhetők.

Ezüst festés

Nagyon érzékeny, fehérjék kimutatására alkalmas, SDS-PAGE gélekhez alkalmas ezüstfestő készletet kínálunk. A következő reagensek szükségesek még hozzá:

• Fixáló oldat
  
       . Etanol (E7023) 50 ml
        Ecetsav 10 ml
        Víz 40 mL
  
  
  
• 30% etanol (E7023) oldat

Eljárás

• Az elektroforetikus futtatás után a gélt 40 percre fixáló oldatba mártjuk. Az egy éjszakán át tartó fixálóban való merítés tisztább hátteret eredményez.
  
• Vegye ki a fixáló oldatot, és mossa a gélt 10 percig 30%-os etanol oldattal, majd mossa 10 percig ultra-tiszta vízzel.
  
• Vezesse le a vizet, és inkubálja a gélt szenzibilizáló oldatban 10 percig.
  
• Vegye ki a szenzibilizáló oldatot, és mossa a gélt kétszer vízzel, mindegyik mosás 10 percig tart.
  
• Távolítsa el a vizet, és merítse a gélt 10 percre ezüstoldatba.
  
• Távolítsa el az ezüstoldatot, és mossa a gélt vízben 1,5 percig.
  
• Dobja ki a vizet, és merítse a gélt fejlesztőoldatba 3-7 percre.
  
• Adjon 5 ml stop-oldatot a fejlesztőoldathoz, és inkubálja 5 percig. Távolítsa el a fejlesztő/stop oldatot, és mossa a gélt 15 percig ultratiszta vízben.
  
• A gél lefényképezhető, és friss, ultratiszta vízben is tárolható.

Kettős festés esetén a gélt CBB R-250-gyel, majd a fenti eljárásokkal ezüstfestéssel fesse meg.

Fluoreszcens festékek: Fehérjeelektroforézishez kínálunk fluoreszcens SYPRO és Lucy festékeket. A géleket vagy sötétben lehet a fluoreszcens festékbe meríteni, vagy a gélt az elektroforézis során katódpufferrel keverni.

A festési protokollok a használt festéktől függnek, és itt találhatók:

• SYPRO^® Ruby Protein Gel Stain (PDF)
  
• LUCY^® 506 oldat (PDF)
  

Visszafordítható gélfestés

Megfordítható gélfestés

A reverzibilis gélfestés lehetővé teszi a felhasználó számára, hogy a fehérjék SDS-PAGE után western blotting eljárással továbbhaladjon.

R-PROB festés: Az R-PROB egy egyedülálló festék, amely a fehérjéket PAGE-géleken és western blotokon detektálja.

Szükséges reagensek:

• Reversible Protein Detection Kit for Membranes and Polyacrylamide Gels (RPROB)
  
• Fixáló oldat
• Fixáló oldat
/a> (F7264)

• 10%-os ecetsav
  


• EDTA 50 mM

Eljárás

• A géleket az elektroforézis után 20 percre fixáló oldatba helyezzük. Ismételje meg ezt a lépést kétszer.
  
• Öblítse át a gélt vízben kétszer, minden mosás 30 percig tart.
  
• Inkubálja a gélt festőoldatban 20-40 percig, enyhe keverés mellett.
  
• Mossa le a felesleges festéket 10%-os ecetsavval.
  
• A festéktelenítéshez mossa le a gélt EDTA-val, majd két, egyenként 15 perces mosás következik vízben vagy fixálóoldatban.

Rézfestés: A fehérjék vándorlásának és elválasztásának megerősítésére a gélt meg lehet festeni egy reverzibilis festékkel, például CuCl₂-val.

Szükséges reagensek

• 0,3 M CuCl₂ oldat
  
• 0.25 M Tris és 0,25 M EDTA oldat

Eljárás

• A géleket az elektroforézis után legfeljebb 30 percig öblítsük desztillált vízben.
  
• Áztassa a gélt 0,3 M CuCl₂ -oldatban 10 percig.
  
• Öblítse le ionmentesített vízzel.
  
• A fehérjék kék háttérben világos zónákként láthatóvá válnak.
  
• A gél Western blothoz való teljes festékmentesítéséhez mossa a festett géleket 0.25 M Tris és 0,25 M EDTA oldattal, pH 9, többször.
  
• A destained gélt transzferpufferbe helyezzük, mielőtt folytatnánk a transzfer beállítását.

2. ábra. Blotting és vertikális elektroforézis rendszer

Ha az elektroforézis után a fehérjéket membránra szeretnénk átvinni, akkor a protokollt itt találja.

Hivatkozás

1. Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.