Nagy molekulájú HPLC
A biomolekulák az élő sejtek által termelt nagyméretű, polimer kémiai vegyületek, amelyek az élő szervezetek alapvető építőköveiként szolgálnak, és számos, az élethez nélkülözhetetlen biológiai folyamatot hajtanak végre. A főbb biomolekulatípusok közé tartoznak a fehérjék, peptidek, polinukleotidok, szénhidrátok, lipidek, vitaminok és koenzimek. A nagy molekulák és biomolekulák szerkezetének jellege, kémiai sokféleségük, a biológiai aktivitás figyelembevételének szükségessége és a komplex mátrixok hatékony jellemzési technikát igényelnek. Bár számos elválasztási és elemzési technika áll rendelkezésre, a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC) használják a leggyakrabban. A biomolekulák sok funkciós csoportja és többféle konformációja miatt a HPLC biomolekula-analízis különböző módokon alapul, mint például fordított fázisú, méret-kiválasztás vagy ioncsere. Függetlenül az alkalmazott elválasztási módoktól, a hatékony oszloptöltés és a következetes állófázis részecskekémia kritikus fontosságú a biomolekulák pontos és megbízható elválasztásához.
KROMATOGRAMMOK KERESÉSE
Kapcsolódó műszaki cikkek
- A gyakori HPLC-problémák kijavítása az oszlop teljesítményének helyreállítása érdekében, a csúcsproblémák, a retenciós idő, a zaj és a kromatogramok felbontásának kezelése.
- Size-exclusion chromatography (SEC) columns and ready-to-use standards facilitate method development and increase robustness of protein SEC methods.
- A méretkizárásos kromatográfiás oszlopok a biomolekulák elválasztásának hatékonyságát 2 μm alatti részecskékkel növelik, javítva az analitikai teljesítményt.
- Supelco’s product offering for biopolymer separations includes columns and media categorized by separation mode, as well as by column brand.
- BIOshell™ IgG 1000 Å C4 columns are highly suited for the reversed phase separation of high molecular weight compounds such as monoclonal antibodies with molecular weight of 150 kDa.
- Mindent látni (79)
Kapcsolódó protokollok
- An optimized LC-MS/MS based workflow for low artifact tryptic digestion and peptide mapping of monoclonal antibody, adalimumab (Humira) using filter assisted sample preparation (FASP).
- A step-by-step protocol for released N-linked glycan analysis of the monoclonal antibody adalimumab, based on UHPLC-FLR-MS and procainamide labeling.
- A complete workflow for the intact and middle-up mass analysis of reduced and non-reduced monoclonal antibodies based on SEC-MS with sample preparation by protein-A affinity clean-up.
- Uncover how HPLC analysis of glycans helps researchers analyze glycan structures and glycoforms & find products to assist in your glycan analysis methods.
- Larger porous shell particles in BIOshell™ columns improve efficiency in U/HPLC analysis of peptides and proteins.
- Mindent látni (29)
További cikkek és protokollok keresése
Reversed-fázisú biomolekula HPLC
A rezervált fázisú HPLC (RP-HPLC) érzékeny és sokoldalú technika, amelyet fehérjék, fehérjefragmentumok és peptidek elválasztására és elemzésére használnak. Az RP-HPLC egy nem poláris állófázist és egy poláris mozgófázist használ. A fehérjék és peptidek visszatartása az állófázison az adszorpciós és a partíciós elveket követi. A hidrofób fehérje régiók reverzibilisen kötődnek az állófázishoz. A fehérjék eluálása a mozgófázis nem poláris jellegének növelésével történik. A felbontást befolyásolhatja a pórusméret, a részecskeméret, az oszlop hossza és az állófázishoz kapcsolódó szénhidrogénlánc.
Méretkizárásos kromatográfia (SEC)
A méretkizárásos kromatográfia (SEC) egy nem denaturáló kromatográfiás mód, amely a molekulákat méretük (azaz hidrodinamikai sugaruk) alapján választja szét. Ez a mód nem az analit és az állófázis közötti kölcsönhatásra, hanem az analit véletlenszerű áramlására támaszkodik az állófázis részecskéin keresztül. A nagy molekulatömegű analitok hamarabb eluálódnak, mivel teljesen vagy részben kizáródnak az állófázis részecske pórusaiból, míg az alacsonyabb molekulatömegű analitok később eluálódnak, mivel több időt töltenek a részecskén keresztülvezető, gyötrelmes útvonal bejárásával. A SEC-t monoklonális antitest (mAbs) aggregátumok és fragmentumok jellemzésére, ismeretlen fehérjemolekulatömegek becslésére és fehérjeformulák stabilitásának meghatározására használták.
Hidrofób kölcsönhatás kromatográfia (HIC)
A hidrofób kölcsönhatás kromatográfia (HIC) olyan kromatográfiás mód, amely az analiteket a hidrofób analit-részek és a hidrofób állófázis ligandumok közötti kölcsönhatás mértéke alapján választja el. Alacsonyabb molekulatömegük és kisebb hajlamuk miatt a HIC-t általában nem használják peptidek elválasztására. Magas sókoncentrációban a fehérjék hidratációs rétegei eléggé megszakadhatnak ahhoz, hogy a hidrofób felületi régiók kapcsolódási felületet képezzenek a nem poláros állófázissal. A só kiválasztását a Hofmeister-sorozat határozza meg, amely a kationokat és anionokat aszerint osztályozza, hogy képesek-e megbontani a fehérje hidratációs rétegét (kaotróp) vagy elősegíteni a fehérje hidratációs rétegének kialakulását (kozmotróp). A tipikus sók közé tartozik az ammónium-szulfát, a kálium-szulfát és a nátrium-szulfát. A hidrofób kölcsönhatáskromatográfiát jelenleg az antitest-hatóanyag konjugátumok (ADC) hatóanyag-antitest arányának (DAR) meghatározására használják.
Ioncserélő kromatográfia (IEX)
Az ioncserélő kromatográfia (IEX) egy olyan kromatográfiás mód, amely az analiteket töltésük alapján választja el. A fehérjék és peptidek amfoterek, azaz savas és bázikus funkcionalitást egyaránt mutatnak. A fehérjék savas funkcionalitásai közé tartozik az aszparaginsav, a glutaminsav, a cisztein, a tirozin és a C-terminális α-karboxilát. A bázikus fehérjefunkciók közé tartozik az arginin, a hisztidin, a lizin és az N-terminális α-amin. A bioterápiás töltésváltozatok az IEX segítségével kimutathatók és felbonthatók. A töltésváltozatok keletkezhetnek a messenger RNS (mRNS) transzkriptum hibás transzlációjából és/vagy poszt-transzlációs módosításokból, például deamidációból, oxidációból vagy glikozilációból.
Az IEX oszlopot az analit izoelektromos pontja (pI) alapján kell kiválasztani. Ha a mobil fázis pH-fázisa alacsonyabb, mint a pI, az analit pozitív töltésű lesz és a kationcserélő oszlophoz kötődik. Ha a mozgófázis pH-ja a pI felett van, az analit negatív töltésű lesz és anioncserélő oszlophoz kötődik.
Affinitás-kromatográfia
Affinitás-kromatográfia az analit és az állófázis ligandum közötti specifikus kölcsönhatásra támaszkodik. Ideális esetben csak a kívánt analit lép kapcsolatba az állófázissal, és az összes többi mintakomponenst átengedi az oszlopon. Ezután egy második mobil fázist vezetnek át az oszlopon az analit eluálásához.
A fehérje A kromatográfia a biofarmáciai iparban alkalmazott affinitáskromatográfia leggyakoribb formája. Az A fehérje egy 42 kDa felszíni fehérje, amely a S. aureus sejtfalában található. Ez a fehérje specifikusan kötődik az IgG-k Fc régiójának nehézláncához, így ideális mechanizmus az IgG-k és más mintakomponensek elválasztására. A legtöbb Protein A oszlopot a fehérje porózus, szerves részecskére történő immobilizálásával állítják elő. A Protein A kromatográfiához azonban monolitikus formátumot is gyártottak, amely lehetővé teszi a nagy mintaátbocsátást különböző áramlási sebességek mellett, a hatékonyság feláldozása nélkül.
Kiemelt események
Kalkulálja ki a futási idő és az oldószerfogyasztás megtakarítását, ha egy módszert HPLC körülményekről UHPLC körülményekre helyez át. Kapjon útmutatást az ellennyomás megváltoztatásához, valamint az injektálási térfogat és a gradiens feltételeinek adaptálásához.
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?