Polimeráz láncreakció

A Technical Guide to PCR Technologies

Az oldalon

• Cycling eljárás
• PCR Assay komponensek
• Eszközök
• Alkalmazás-specifikus PCR-módosítások

A polimeráz láncreakció (PCR)^1,2,3 a molekuláris biológia egyik legszélesebb körben használt technikájává vált. Az alapkutatástól a nagy áteresztőképességű szűrővizsgálatokig terjedő alkalmazásokban használják. Bár nagy teljesítményű technikáról van szó, az általános elterjedtség és az alkalmazások sokszínűsége látszólagos egyszerűségének és viszonylag alacsony költségének köszönhető. A technikát specifikus, célzott DNS-töredékek felerősítésére használják kis mennyiségű forrás-DNS-ből vagy RNS-ből (a komplementer DNS (cDNS) előállítására irányuló fordított átírási lépés után, lásd Reverse Transcription). A PCR egyik nagy előnye, hogy a célszekvenciákat egyetlen példány kiindulási anyagból is fel lehet sokszorozni, még akkor is, ha a templát lebomlott és inhibitorokkal szennyezett. Például ősi  egyiptomi múmiákból kivont DNS-en végeztek vizsgálatokat Tutanhamon király családtagjainak⁴ azonosítására. A PCR még a nagyobb filmekben és a legtöbb krimisorozatos tévéjátékban is szerepel a "nyomozás" valamelyik szakaszában, még ha kissé túlfikcionáltan is. 

PCR Cycling Process

A tipikus PCR a következőkből áll:

• Eredeti denaturálás: A reakció hőmérsékletét 95 °C-ra emeljük, és a reakciót 2-5 percig inkubáljuk (az enzim jellemzőitől és a templát összetettségétől függően akár 10 percig is), hogy az összes összetett, kettős szálú DNS (dsDNS) molekula szétváljon az amplifikációhoz szükséges egyszálúvá.
  
  
• Ciklus:
  
  
  1. Denaturálás: A reakcióhőmérsékletet 95 °C-ra emeljük, ami az összes dsDNS-t egyszálú DNS-é (ssDNS) olvasztja (felbontja a komplementer bázisok közötti hidrogénkötéseket).
     
  2. Annealing: A hőmérsékletet körülbelül 5 °C-kal a primerek olvadási hőmérséklete (T_m) alá csökkentjük (gyakran 45-60 °C), hogy elősegítsük a primerek kötődését a templáthoz.
     
  3. Hosszabbítás: A hőmérsékletet 72 °C-ra emeljük, ami optimális a DNS-polimeráz aktivitása szempontjából, hogy a hibridizált primerek meghosszabbodhassanak.
     

• Megismétlés: Az 1-3. lépéseket ciklikusan végezzük, ami az amplikon exponenciális amplifikációját eredményezi (2. ábra.1 és 2.2).

Az

PCR a reakció melegítésének és hűtésének ciklusaiból áll. Minden egyes hőmérsékleti plató a reakció egy meghatározott szakaszának szabályozására szolgál, az inkubációs idők pedig a műszertől, a reakciólemezektől vagy -csövektől és a reagensektől függnek. Ezeket minden egyes kísérlethez optimalizálni kell, különösen, ha fokozott detektálási érzékenységre van szükség⁵.

A kezdeti denaturációs fázis egy magas hőmérsékleten töltött időszakból áll, amely során a komplex kettős szálú DNS (dsDNS) másodlagos szerkezete egyszálú DNS-é (ssDNS) olvad. Mivel a DNS-t magas hőmérsékletnek tesszük ki, ennek a fázisnak elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy az összes szál szétváljon, és így rendelkezésre álljon a primereléshez, de nem olyan hosszúnak, hogy a DNS károsodjon. A kezdeti (vagy az azt követő) denaturálási lépések során bekövetkező károsodás vagy a nem teljes denaturáció a detektálás érzékenységének csökkenését eredményezi⁵.


A ciklikus ciklust elindító rövidebb denaturálási lépés során (10 másodperctől 1 percig 95 °C-on) a célszekvencia DNS-szálai szétválnak, és egyszálúvá válnak, akárcsak a kezdeti denaturálási szakaszban. A reakciót ezután lehűtjük a primerek lágyítási hőmérsékletére.


A lágyítási lépésre (30 másodperctől 1 percig, 45-60 °C-on) azért van szükség, hogy a primerek a DNS egyes szálain lévő komplementer szekvenciákhoz kapcsolódjanak. A primereket úgy tervezik meg, hogy a kívánt célpontot zárójelbe tegyék, és a közöttük lévő szekvenciarégiót amplikonnak nevezzük. Általában a lágyítási hőmérséklet 5 °C-kal alacsonyabbra becsülhető, mint a primer-minta DNS-duplex olvadási hőmérséklete.


A végső lépés a hosszabbítási lépés (20 másodperctől 1 percig 72 °C-on), amelyet úgy végzünk, hogy a DNS-polimeráz meghosszabbítja a primer szekvenciákat az egyes primerek 3' szakaszától az amplikon végéig. Az 1 perces hosszabbítás általában elegendő a legfeljebb 2 kilobázist (kb) elérő PCR-fragmentumok szintéziséhez. Nagyobb fragmentumok amplifikálásához az elongációs lépést kb-nként 1 percig hosszabbítjuk. Az első hosszabbítás során a templát nem lesz hosszkorlátozó, így az amplikon hosszát meghaladó templátok szintetizálódnak. A további hosszabbítási lépések során az amplikon hosszát a primer szekvencia határozza meg mindkét végén.

2.1. ábra. Egy tipikus PCR egyes reakciófolyamatainak ábrája.

2.2. ábra. Egy elméleti PCR során a célamplikon mennyisége minden egyes ciklusban megduplázódik, ami a célszekvencia exponenciális amplifikációjához vezet (az X tengely a PCR-ciklusokat, az Y tengely pedig az amplikonmolekulák teljes számát mutatja).

A második ciklus kezdetén kétféle templát van a reakcióban; az eredeti DNS-szálak és az újonnan szintetizált DNS-szálak, amelyek a primer szekvenciából állnak, amelyet a 3' végén meghosszabbított amplikon változó hosszúságú része követ. A megmaradt eredeti DNS-szálak, amelyeket az első ciklusban nem primereltek, a második ciklusban befoghatók, és a primerből és a hosszabbító termékből álló molekulákat eredményeznek. Az első ciklusból származó, primerrel feltöltött és meghosszabbított molekulák lesznek a templát az újonnan szintetizált anyaghoz komplementer primerek számára.

A harmadik ciklusban a második ciklusból származó, újonnan szintetizált célrégiós DNS csak az amplikont tartalmazza, és így specifikus templát lesz.

A ciklust folyamatosan ismételjük, ami a másolt szekvenciák exponenciális amplifikációját eredményezi (2.2. ábra). A szükséges ciklusok száma a PCR-termék kívánt hozamától függ. Ez viszont a kiindulási kiindulási kópiaszámtól és az amplifikáció hatékonyságától függ. Mivel a kiindulási anyag és a végtermék relatív koncentrációja hihetetlenül alacsony (pl, 1/5,5¹¹ ha egyetlen molekulát 40 ciklusos amplifikációnak vetünk alá, és minden ciklusban 100%-os hatékonyságot érünk el, 2. ábra.1), a reakció végén keletkező DNS szinte kizárólag a PCR-amplikon.

Bár az elméleti PCR-nek folyamatos exponenciális amplifikációt kellene eredményeznie, a reakció végül elér egy platófázist. Úgy tűnik, hogy ez a DNS-polimeráz nem specifikus kötődésének köszönhető a DNS-termékekhez^6,7. Ez jól láthatóvá válik, ha kvantitatív valós idejű PCR-t (qPCR) alkalmazunk és a fluoreszcens jelölések változását figyeljük (lásd Kvantitatív PCR).

A reakció végén az amplifikációs termékeket gélelektroforézissel elemzik. Az előállított mennyiségtől és az amplifikált fragmentum méretétől függően a reakciótermékek közvetlenül láthatóvá tehetők a gél etídium-bromiddal történő festésével (2. ábra.3) vagy a közelmúltban bevezetett festékek, például BlueView™ ⁸ használatával.

2.3. ábra. Egy példa hagyományos PCR-termékekre, amelyeket etídium-bromiddal festett agarózgélen keresztül oldanak fel. Duplex PCR-t futtattunk 2 célpont egyidejű kimutatására, amelyek mindegyike eltérő méretű. Mindkét fragmentum különálló sávokként látható (a kép Marion Grieβl jóvoltából).

PCR Assay Components

Az alábbiakban összefoglaljuk a PCR-hez szükséges komponenseket. Ezek közül számosat további részletesen ismertetnek a külön fejezetek, valamint az útmutató végén található részletes, szabványos PCR-protokollok (Appendix A).

Template

Az RNS és a DNS tisztítására számos módszer áll rendelkezésre. Bár ezek mind alkalmasak, nem biztos, hogy mindegyik egyforma. A sablon szennyeződése a mintaforrásból származó más anyagokkal a PCR gátlásához, szélsőséges esetben pedig a vizsgálat teljes kudarcához vezethet. Van néhány példa arra, hogy a szennyeződések még a reakció fokozódását is eredményezhetik^9,10. Lásd Mintatisztítás és minőségértékelés a mintatisztításról és minőségellenőrzésről szóló további részletekért, valamint Reverse transzkripció a reverz transzkripciós (RT) reakciókkal kapcsolatos információkért. Általában 10 ng-1 μg genomi DNS-t (gDNS) adunk 20-100 μL PCR próbákhoz, míg a cDNS szintézisreakciókat 1/5-1/10 arányban hígítjuk, és 5 μL-t adunk 20-50 μL reakciókhoz.

Primerek

A ligonukleotid primerek jellemzően 15-25 nukleotid hosszúságúak, 40-60% GC-vel és T_m -vel, amely a pár minden
tagja esetében hasonló. Egy egyszerű módszer a rövid oligók (<25 bázis) T_m értékének megállapítására a képlet¹¹ használata:

T_m = 4(G + C) + 2(A + T)

Lásd PCR/qPCR/dPCR Assay Design a primerek tervezésével és kezelésével kapcsolatos további részletekért. Az ideális kiindulási hőmérséklet a lágyításhoz a becslések szerint 5 °C-kal alacsonyabb, mint az olvadási hőmérséklet. A lágyítási hőmérséklet hőmérséklet-gradiens PCR-blokk segítségével optimalizálható. A hőmérséklet optimalizálására vonatkozó protokollt (a qPCR példáján keresztül) a A függelék A tartalmazza.

DNS-polimeráz

A DNS-polimeráz enzimek nagy választéka létezik, és kritikus fontosságú, hogy a megfelelő enzimet a kísérlet definíciója alapján válasszuk ki (nem egyszerűen az adott enzim elérhetősége alapján a laboratóriumi fagyasztóban). Például egyes enzimeket úgy terveztek, hogy alacsony hőmérsékleten inaktívak legyenek, és a nemspecifikus amplifikáció csökkentése érdekében hotstart protokollokban használják őket, míg mások alacsony hibaaránnyal rendelkeznek, és a klónozásra szánt fragmentumok amplifikációjához választják őket.

dNTP-k

A PCR-ben az egyes dNTP-k (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) koncentrációja általában 200 μM. A dNTP-koncentrációnak azonban többletnek kell lennie, és hosszú fragmentumok vagy nagy mennyiségben előforduló célpontok amplifikálásához szükség lehet a koncentráció növelésére. A közelmúltban továbbfejlesztették a PCR-pufferkomponenseket, például CleanAmp™ dNTPs¹². Ezek olyan módosított nukleozid-trifoszfátok, amelyek blokkolják a DNS-polimeráz nukleotid beépülését.  CleanAmp dNTPs a tipikus hot start ciklikus körülmények között a kezdeti melegítési lépés és az azt követő denaturáló lépések során aktiválódnak. Ez az eljárás a PCR minden egyes ciklusa során korlátozza a rendelkezésre álló aktivált dNTP-k mennyiségét, ami lehetővé teszi a kívánt termék specifikusabb és hatékonyabb amplifikációját. Ezzel együtt csökkentik, vagy teljesen elkerülik a hibás primerképződést vagy a primer dimerképződést, és ezért alternatívát jelentenek a hot start DNS-polimerázok helyett.

MgCl₂ koncentráció

Free Mg²⁺ ionok szükségesek a DNS-polimeráz aktivitásához kofaktorként; azonban a Mg²⁺ ionok komplexeket képeznek dNTP-kkel, primerekkel és DNS-templátokkal. Ezért az MgCl₂ optimális koncentrációját minden egyes kísérlethez különböző koncentrációkat tartalmazó reakciók tesztelésével kell kiválasztani. MgCl₂ koncentrációja általában 1,5-5 között van.5 mM, de az optimalizálás során 1-8 mM tartományban is tesztelhető (lásd Assay-optimalizálás és validálás).

Fluoreszcens címkék

A fluoreszcens festékeket akkor építik be a reakcióba, ha az amplikont közvetlenül kell detektálni, például qPCR vagy digitális PCR (dPCR) beállítás esetén. Ezeket a pufferbe teszik, vagy a primerekhez vagy további szondákhoz csatolják (lásd Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods).

Instruments

Eredetileg a PCR elvégzése munkaigényes volt, mivel a reakciócsöveket fizikailag kellett mozgatni 3 vízfürdő között, amelyek mindegyikét a denaturációhoz, lágyításhoz és megnyúláshoz szükséges hőmérsékletre állították be. A reakció tetejére olajat adtak a párolgás megakadályozására, és az elemzés bonyolult volt az olaj interferenciája nélkül. Manapság a kereskedelemben kapható számos speciális hőciklusos műszer egyikét szokás használni. A lemez- és blokkformátumok 48, 96 vagy 384 üregűek között változnak, és kompatibilisek a többcsatornás pipettákkal. A legtöbbjük fűtött fedelet használ, amely kiküszöböli az olajos felületi réteg szükségességét. Léteznek azonban nagy áteresztőképességű, az eredeti vízfürdő elvén alapuló műszerek¹³.

Alkalmazásspecifikus PCR-módosítások

A PCR különböző származékai reakciómódosításokat igényelnek. Néhány ilyen, népszerű alkalmazásokhoz szükséges módosítást találunk itt.

Klónozás

A PCR alkalmazható kiválasztott szekvenciák felerősítésére vektorba történő beillesztés céljából. Ezek a szekvenciák módosíthatók úgy, hogy a klónozó enzimek felismerése érdekében meghatározott régiókat (farok) tartalmazzanak. A vektorra irányított primereket a már vektorokba klónozott fragmentumok izolálására használják. A PCR lépésekhez alacsony hibaarányú DNS-polimeráz enzimre van szükség.

Sequence Tag Sites

Ezeket a primerek 5' végébe tervezik, és a nagy áteresztőképességű szekvenálás során használják, amikor a specifikus tagre van szükség annak jelzésére, hogy egy kiválasztott klónban egy adott minta genomjának egy adott szegmense van jelen, így a genomiális szekvenciaadatok dekonvolutálhatók és az eredeti forrásmintához rendelhetők.

Site-direktált mutagenezis

A fehérje funkciójának tanulmányozásához egy DNS-szekvenciába a kívánt mutációt lehet bevinni. A kívánt bázisváltozást a primerekbe (az 5' vég felé) építik be, amelyek a szükséges klónozó enzim restrikciós helyeit is tartalmazzák. Egy alternatív megközelítés többlépéses protokollt alkalmaz, amelynek során a célpontra specifikus és a klónozási helyeket tartalmazó primereket a kívánt mutációt tartalmazó primerekkel együtt használjuk.

Hivatkozások

1. Saiki R, Scharf S, Faloona F, Mullis K, Horn G, Erlich H, Arnheim N. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230(4732):1350-1354. https://doi.org/10.1126/science.2999980

2. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. 1986. Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51(0):263-273. https://doi.org/10.1101/sqb.1986.051.01.032

3. Mullis KB, Faloona FA. 1987. [21] Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.335-350. https://doi.org/10.1016/0076-6879(87)55023-6

4. Hawass Z. 2010. Ancestry and Pathology in King Tutankhamun's Family. JAMA. 303(7):638. https://doi.org/10.1001/jama.2010.121

5. Douglas A, Atchison B. 1993. Degradation of DNA during the denaturation step of PCR.. Genome Research. 3(2):133-134. https://doi.org/10.1101/gr.3.2.133

6. Morrison C, Gannon F. 1994. The impact of the PCR plateau phase on quantitative PCR. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1219(2):493-498. https://doi.org/10.1016/0167-4781(94)90076-0

7. Kainz P. 2000. The PCR plateau phase ? towards an understanding of its limitations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1494(1-2):23-27. https://doi.org/10.1016/s0167-4781(00)00200-1

8. BlueView Nucleic Acid Stain. 2012; Product No. T9060.

9. Witt N, Rodger G, Vandesompele J. An assessment of air as a source of DNA contamination encountered when performing PCR. J Biomol Tech2009; 20: .236-240.

10. Huggett JF, Novak T, Garson JA, Green C, Morris-Jones SD, Miller RF, Zumla A. 2008. Differential susceptibility of PCR reactions to inhibitors: an important and unrecognised phenomenon. BMC Research Notes. 1(1):70. https://doi.org/10.1186/1756-0500-1-70

11. Wallace RB, Shaffer J, Murphy R, Bonner J, Hirose T, Itakura K. 1979. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to ?X174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucl Acids Res. 6(11):3543-3558. https://doi.org/10.1093/nar/6.11.3543

12. CleanAmp. 2012; Product No. DNTPCA1.

13. GC Biotech. Hydrocycler. GC Biotech 2012.