Telep PCR

A kolónia PCR egyszerű és gyors módszer a klónozott DNS-konstrukció helyes összeállításának ellenőrzésére. Hagyományosan a klónozás során a DNS beillesztésének ellenőrzése időigényes volt, a baktériumtranszformációt követően, a DNS fáradságos DNS-tisztításával és az azt követő restrikciós enzimes emésztéssel. A kolónia PCR egy Direct PCR módszer, amely megkerüli a DNS izolálását és a restrikciós emésztést, így gyors, egyszerű és olcsó megoldást kínál a klónozott konstrukciók szűrésére. A kolónia PCR alkalmazások kompatibilisek a szekvencia- és restrikció-független módszerekkel létrehozott klónok szűrésével is.

• Kolóniás PCR protokoll
• Telep PCR alkalmazások baktériumokkal és élesztőkkel
• A növekedési közeg hatása a JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ reagensek használatával a PCR hozamára
• Kolóniás PCR és kapcsolódó PCR-termékek

REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ és JumpStart™ REDTaq^®. PCR ReadyMix™ for Ckolónia PCR Aalkalmazások

Kolónia PCR alkalmazásokhoz alkalmas REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ (Cat. No. R4775) és a JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ (Cat. No. P0982) egyaránt puffert, polimerázt, dNTP-ket és stabilizátorokat tartalmaz egyetlen 2x-es oldatban. Úgy vannak összeállítva, hogy lehetővé tegyék a közvetlen PCR-t, majd a PCR után a minták agaróz gélre töltését, további pufferek vagy töltőfestékek nélkül. Az inert festék ugyanolyan sebességgel vándorol, mint egy 125 bázispáros fragmentum, így vizuálisan is megerősíti a DNS migrációját.

Jellemzők és előnyök

• Elképesztő rugalmasság: Az amplifikáció előtt nincs szükség DNS-tisztításra. Alkalmas a szokásos E. coli törzsekkel, például a SIG10 5a, NovaBlue (K-12), BL21(DE3) és DH5α törzsekkel, valamint S. pombe élesztővel való használatra. A minta újraamplikálható, például nested PCR-ben is.
• Nagy specifikusság és nagy hozam: A JumpStart™  Taq DNS-polimerázt, egy antitestekkel inaktivált hot start enzimet úgy tervezték, hogy minimalizálja a nem specifikus amplifikációt, miközben növeli a célpont hozamát   specificitását. A JumpStart^™ Taq akár 7 kb hosszúságú célpontokat is felerősít.
• Kényelem: A JumpStart™  termékek forró indítási funkciói lehetővé teszik a reakció szobahőmérsékleten történő beállítását, ami több mintával való munka esetén előnyös. A REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ és a JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ 4 °C-on vagy -20 °C-on is stabil.
• Inhibitor-tűrés: A JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ bizonyítottan tolerálja az LB koncentrációt 20%-ig, az LB Agar vagy Terrific Broth pedig 10%-ig.
• Reprodukálhatóság: Csökkenti a több pipettalépésből eredő szennyeződés kockázatát, és konzisztens teljesítményt biztosít több reakció során.
• Gélkész: Nincs szükség töltőpuffer vagy nyomkövető festék hozzáadására. A PCR-termék az amplifikáció után közvetlenül agarózgélbe töltődik. A vörös nyomjelző körülbelül ugyanolyan sebességgel vándorol, mint egy 125bp fragmentum (valamivel gyorsabban, mint a brómfenol-kék).

Ckolónia PCR Pprotokoll

A kolónia PCR protokoll egyszerű: egyszerűen adjunk egy kis mennyiségű kolóniát egy lemezről vagy sűrű baktérium-folyadékkultúrából a PCR master mixhez, és folytassuk a termociklizálást. A sejtlízis a kezdeti magas hőmérsékletű inkubáció során történik. A keletkező PCR-termékek gélelektroforézissel vagy más DNS-kimutatási módszerekkel elemezhetők. Ez az időtakarékos módszer tökéletesen alkalmas néhány kolónia szűrésére vagy sok klón nagy áteresztőképességű szűrésére.

1. Készítse el a PCR master mixet (az elemzendő minták száma alapján méretezve):

Reagens	Térfogat (reakciónként)
REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™. vagy JumpStart™ REDTaq® PCR ReadyMix™	10 µL
Előre irányuló primer (20 µM)	0.5 µL
Reverse Primer (20 µM)	0.5 µL
Víz
Víz	9 µL
összesen	20 µL

2. Adagoljuk a PCR master mixet (20 µl) minden egyes PCR-csőbe vagy -lemezbe.
3. Steril mikropipettahegy vagy steril fogpiszkáló segítségével helyezze át a sejteket minden egyes kolóniából egy PCR-csőbe, és rövid keverés után szuszpendálja őket újra a PCR master mixben. A keverék kissé zavarosnak tűnhet. Megjegyzés: Ne vegyen ki túl sok sejtet. A sejtek túlterhelése megzavarja a PCR-t.
4. Amplifikálja a cél-DNS-t a következő termociklikus körülmények között:

Step	Hőmérséklet		Az idő	Ciklusok
Sejtlízis	94 °C	5-10 perc	1	1 /p>
Denaturálás	94 °C	0.5 perc	30-40
Lágyítás	45 és 68 °C között	0.5 perc
Hosszabbítás	< 72 °C	1-2 perc (~ 1 kb/perc)
Hold	4 °C	Kétségtelenül

Megjegyzés: A sejtlízis lépése hosszabb, mint egy tipikus kezdeti denaturálás a baktériumfal hatékony megbontása érdekében

5.        A PCR után töltsön 5-10 µl-t minden reakcióból közvetlenül egy 1%-os agaróz gélbe, hagyva egy sávot a megfelelő létrának, és végezze el az elektroforézist.

Colony PCR Aalkalmazások with Bbaktériumok és Yélesztő

A kolónia PCR-t reprezentatív baktérium- és élesztőtörzsekkel végeztük. E. coli kompetens sejteket SIG10 5a (kat. sz. CMC0001), NovaBlue (kat. sz. 69825), BL21(DE3) (kat. sz. 69450) és DH5α (Thermo Fisher Scientific) transzformáltunk a beillesztett szekvenciát tartalmazó pET28a(+)-val. A SIG10 5a-t üres pET28a(+) vektorral is transzformáltuk. A E. coli kolóniákat REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ és az inszert 1 kbp-nyi részét amplifikáló flankáló primerek segítségével vizsgáltuk inzertekre. A E. coli minden törzse kompatibilis volt a kolónia PCR-rel, a célamplikonokat közvetlenül a nyers sejtbemenetekből állították elő DNS extrakciós lépés nélkül (1. ábra).

1. ábra Agaróz gél a E. coli kolónia PCR termékekből. Az 1 kbp méretű inzert kolónia PCR-jét a REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ segítségével végeztük el, és 1%-os agaróz gélen elemeztük. Az összes transzformált sejtből, amelyek pET28a(+) inzertet tartalmaztak (3-10. minta), termékeket detektáltunk, míg a pET28a(+) üres vektorral transzformált sejtekből (1-2. minta) nem amplifikáltunk terméket.

Schizosaccharomyces pombe élesztőt transzformáltunk a pESP-1-gyel. A kapott kolóniákon és a plazmid kontrollon PCR-t végeztünk. Az élesztőtelepeket JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ és az inszert 226 bp-nyi részét amplifikáló flankáló primerek segítségével vizsgáltuk inzertekre.  A E. coli-hoz hasonlóan a célszekvenciákat DNS-tisztítás nélkül amplifikáltuk az élesztőmintákból (2. ábra).

2. ábra Agaróz gél a S. pombe kolónia PCR termékeiből. A 226 bp-os inzert kolónia PCR-jét JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ segítségével végeztük el, és 1%-os agaróz gélen elemeztük. Az összes transzformált sejtből (Colony 1-3) és plazmid templátból (Control) származó termékeket detektáltunk.

Ehatás az Gnövekedés Media on PCR Yield Using./span> JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ Reagents

A növekedési közeg szennyeződésének a PCR-re gyakorolt hatásának számszerűsítésére közös E. coli közegek LB, LB Agar és Terrific Broth (TB) tüskékkel kerültek a JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ reagensekbe. Az amplifikációt a pBR322 mint templát, megfelelő primerek, α [32P] dCTP és változó mennyiségű (0-50%) LB, LB Agar és TB felhasználásával végeztük. A PCR-hozamot üvegszűrőn történő triklór-ecetsavas kicsapást követően határoztuk meg, amelyet szcintillációs számlálás követett. A hozamokat 0%-os hozzáadott táptalajra normalizáltuk. A reakciókat három példányban végeztük. Minden médium hozzáadása befolyásolta a termékhozamot, de a JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ PCR használatával a PCR még akkor is robusztus volt, ha a reakcióelegy legfeljebb 20%-a LB, és legfeljebb 10%-a TB vagy LB agar volt (3. ábra). Ezek a szintek meghaladják azt, ami egy tipikus kolónia PCR-t szennyezne, és bizonyítják a JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ reagensek magas inhibitor-toleranciáját.

3. ábra A PCR ReadyMix™ reagensek LB, LB agar és TB spiccelésének hatásai. LB, rózsaszín négyzetek; LB agar, kék rombuszok; TB, zöld háromszögek.

Colony PCR Pteljesítmény with JumpStart^TM és REDTaq^® ReadyMix^™ Reagents

eagents

REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™, JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ és más JumpStartsup>™ és REDTaq^® ReadyMix^™ termékek, mint például az R2523 és a P1107 olyan robusztus mesterkeverékek, amelyek lehetővé teszik a gyakori klónozó és expressziós törzsekből származó kolóniák és tenyészetek közvetlen PCR-jét, beleértve az E. coli és S. pombe, megkönnyítve a klónozott konstrukciók gyors szűrését. Nagy toleranciával rendelkeznek a gyakori PCR-inhibitorokkal szemben, beleértve a 20%-ig terjedő LB-koncentrációkat és a 10%-ig terjedő LB-agar vagy Terrific Broth-t, ami nagy teljesítményt eredményez a kolóniás PCR-ben. A mesterkeverékek képesek legyőzni a sejttörmelék hatásait, és közvetlenül használhatók nyers telepekkel vagy szuszpenziókkal akár 7 kb hosszúságú célpontok amplifikációjára. További ultragyors PCR mesterkeverékek, köztük a KOD One^™ PCR Master Mix is rendelkezésre állnak, és alkalmasak kolónia PCR alkalmazásokhoz. További PCR-reagensek és forrásokért fedezze fel PCR-reagents and Kits resource hub.