Az oldalon
A kvantitatív PCR (hivatalosan kvantitatív valós idejű PCR, qPCR) detektálás az alapvető PCR technikára épül, és lehetővé teszi a kutatók számára, hogy megbecsüljék a mintában lévő kiindulási anyag mennyiségét. Mivel a termékek kimutatása a reakció előrehaladtával történik, a qPCR sokkal szélesebb dinamikai tartományban elemezhető, mint a hagyományos, végpontos PCR; egyetlen futtatás során egyetlen példánytól körülbelül 1011 kópiáig kimutatható. A kvantitatív valós idejű PCR és az azt követő amplikon kimutatás zárt csöves formátumban történik, ami kiküszöböli a PCR utáni manipuláció, például a gélelektroforézis szükségességét, és jelentősen csökkenti a keresztkontamináció kockázatát.
A qPCR alapelveit ezen az oldalon tárgyaljuk, a gyakori detektálási vegyszerek mechanizmusait pedig a Kvantitatív PCR és digitális PCR detektálási módszerek.
Az alapelvek.
A qPCR elvégzésekor egy fluoreszcens riporterfestéket használnak az egyes amplifikációs ciklusok során jelen lévő nukleinsav mennyiségének közvetett mérésére. A fluoreszcens jel növekedése egyenesen arányos a reakció ismétlődő fázisai során keletkező, exponenciálisan felhalmozódó PCR-termékmolekulák (amplikonok) mennyiségével (lásd Polimeráz-láncreakció). A riportmolekulák a következő kategóriákba sorolhatók; kettős szálú DNS-hez (dsDNS) kötődő festékek, primerekhez konjugált festékek vagy további festékkel konjugált oligonukleotidok, az úgynevezett szondák (Kvantitatív PCR és digitális PCR detektálási módszerek).
A dsDNS-kötő festék, például a SYBR® Green I használata jelenti a detektálási kémia legegyszerűbb formáját. Szabad oldatban vagy csak egyszálú DNS (ssDNS) jelenlétében a SYBR Green I festék alacsony jelintenzitású fényt bocsát ki. A PCR előrehaladtával és a dsDNS mennyiségének növekedésével több festék kötődik az amplikonokhoz, és így a jelintenzitás is növekszik.
Alternatívaként egy szonda (vagy kettő kombinációja a detektálási kémiától függően) a dsDNS-kötő festéken túlmenően a detektálási specifikusság egy szintjét is hozzáadhatja, mivel a templát egy meghatározott régiójához kötődik, amely a primerek között helyezkedik el. A leggyakrabban használt szondaformátum a kettős jelölésű szonda (DLP; más néven hidrolízis vagy TaqMan® szonda). A DLP egy oligonukleotid, amely egy 5' fluoreszcens jelöléssel, pl. 6-FAM™ és egy 3' fojtó molekulával, mint például a sötét fojtók egyikével, pl., BHQ®1 vagy OQ™ (Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods). Ezeket a szondákat úgy tervezték, hogy a két primer közötti templátra hibridizálódjanak, és olyan DNS-polimerázzal együtt használják, amely inherens 5'-3'-exonukleáz aktivitással rendelkezik. Amikor a DLP szabadon van oldatban, a jel intenzitása alacsony, mivel a riporterfesték a fojtószer-rész közelében van. Ahogy a reakció során egyre több templát keletkezik, egyre több szonda hibridizálódik a templáthoz, amelyeket viszont a továbbhaladó DNS-polimeráz 5'-3' exonukleáz aktivitása hasít. A fluoreszcens jel intenzitása növekszik, ahogy az 5' riporterfesték az oldatba kerül. A különböző riporterfestékekkel jelölt szondák használata lehetővé teszi több célpont egyidejű kimutatását és mennyiségi meghatározását egyetlen (multiplex) reakcióban.
A tipikus qPCR-futtatás váltakozó hőmérsékletű inkubációk többszöri ciklusaiból áll, Cycling Procedure 3.1.. Ezt a profilt gyakran használják, amikor dsDNS-kötő színezékek, Molecular Beacons vagy Scorpion® Probes a qPCR-hez választott detektáló kémiai anyagok. A primerek hosszabbítása 72 °C-on a leghatékonyabb, mivel ez az optimális hőmérséklet a legtöbb DNS-polimeráz processzivitásához. 72 °C-on a polimerizáció körülbelül 100 bázis/másodperc sebességgel történik. Azonban alacsonyabb hőmérsékleten is van olyan feldolgozhatóság, amely elegendő a rövidebb templátok amplifikálásához. A qPCR amplikonok jellemzően rövidebbek (<200 bázis), mint a hagyományos PCR-termékek, ezért a hosszabbítást gyakran kombinálják a lágyítással egyetlen 60 °C-os lépésben, amikor kettős jelölésű próbákkal dolgoznak (3.2. ciklikus eljárás).
Cycling Procedure 3.1
Példa egy standard qPCR-profilra dsDNS-kötő festék, Molecular Beacon vagy Scorpions® Probe detektálással.
- Kezdő denaturáció: A reakció hőmérsékletét 95 °C-ra emeljük, és a mintát 2-10 percig inkubáljuk (az idő a polimeráz enzim hot start mechanizmusától függ), hogy az összes komplex célpont (dsDNS) szétváljon, egyszálúvá váljon és elérhető legyen az amplifikációhoz
- Ciklusozás:
- Denaturálás: A reakció hőmérsékletét 10 másodpercre 95 °C-ra emeljük, hogy az összes dsDNS megolvadjon.
- Annealing: A hőmérsékletet 30 másodpercre 60 °C-ra csökkentjük, hogy elősegítsük a primer és a szonda (ha van benne) kötődését a templáthoz.
- Hosszabbítás: Az ezt követő elongáció 72 °C-ra emelt hőmérsékleten történik, ami optimális a TaqDNS-polimeráz processzivitásához. A hosszabbítás időtartama az amplikon méretétől függ (1 kb-onként 30 mp). Az elongáció időtartama az amplikon kívánt hosszától és az alkalmazott enzimtől függ. Mivel a qPCR amplikonok rövidek, ez jellemzően 5-30 sec.
- Denaturálás: A reakció hőmérsékletét 10 másodpercre 95 °C-ra emeljük, hogy az összes dsDNS megolvadjon.
- Megismétlés: Az 1-3. lépést megismételjük, általában 40 cikluson keresztül.
Ciklikus eljárás 3.2
Egy példa kétlépéses ciklikus qPCR profil DLP kimutatására.
- Kezdő denaturálás: A hőmérsékletet 95 °C-ra emeljük, és a reakciót 2-10 percig inkubáljuk (a polimeráz enzim hot start tulajdonságaitól függően)
- Ciklizálás:
- Denaturálás: A reakció hőmérsékletét 10 másodpercre 95 °C-ra emeljük, hogy az összes dsDNS megolvadjon.
- Annealing és hosszabbítás: A hőmérsékletet 30 másodpercre 60 °C-ra csökkentjük, hogy elősegítsük a primer kötődését a templáthoz, majd a DNS-polimeráz megfelelő aktivitása miatt ezen a hőmérsékleten történik a hosszabbítás.
- Megismétlés: Az 1-2. lépést általában 40 cikluson keresztül megismételjük.
A reakció során a fluoreszcencia változását valós idejű PCR termikus ciklerrel mérjük. A dedikált valós idejű PCR-műszerek kombinálják a hőciklust egy optikai egységgel. Az optikai egység megfelelő hullámhosszúságú fényt biztosít a fluorofór gerjesztéséhez, és detektálja a keletkező emissziót. Sok modern műszer rendelkezik egy rögzített képernyővel vagy egy közeli számítógépes monitorral, amely lehetővé teszi a reakció követését a reakció előrehaladása során (3.1. ábra).
3.1. ábra.Példa qPCR Assay adatok. A) A reakció különböző fázisai. Alapvonal: A templát kezdeti koncentrációja alacsony; ezért a fluoreszcencia intenzitása túl alacsony ahhoz, hogy kimutatható legyen, és csak a háttérjel látható. Exponenciális: Miután a target-hozam elérte a detektálási küszöbértéket, amelyet a piros küszöbvonal mutat, a reakció lefolyása az exponenciális fázison keresztül követhető. Lineáris: A templát koncentrációjának növekedésével a rendelkezésre álló DNS-polimeráz koncentrációja csökken, és a reakciósebesség csökken. Plateau: A reakció a maximális hozamot éri el. B) Az egyes reakciókat azzal a ciklussal jellemezzük, amikor a fluoreszcencia először emelkedik a küszöbérték fölé, amelyet kvantitatív ciklusnak (Cq) nevezünk. Ha a kiindulási anyag bőséges, az amplifikáció korábbi ciklusokban figyelhető meg, és a Cq alacsonyabb. Ha a kiindulási anyag kevés, az amplifikáció a későbbi ciklusokban figyelhető meg, és a Cq magasabb. A fluoreszcencia, a Cq és az amplifikált termék mennyisége közötti korreláció lehetővé teszi a templát mennyiségi meghatározását széles dinamikai tartományban.
GDNS-célpontok mennyiségi meghatározása és elemzése
A gDNS-célpontok elemzésére könnyen alkalmazható a kvantitatív valós idejű PCR. Ilyen vizsgálatok lehetnek genotipizálás/SNP
meghatározás, metilációs elemzés, transzgenikus szekvenciák szűrése vagy inszerciók és deléciók nyomon követése.
Az mRNS-transzkriptumok mennyiségi meghatározása és elemzése
A qPCR gyakori alkalmazása a génexpresszió elemzése, pl.g., egy adott gén mRNS-koncentrációjának összehasonlítása a kontroll és a kezelt minták között. Az mRNS mennyiségi meghatározása történhet kétlépéses vagy egylépéses RT-qPCR eljárással (lásd Reverse Transcription Quantitative Real-time PCR, az RT-reakciók további részleteiért).
Kétlépéses RT-qPCR
A reverz transzkripciós és qPCR-reakciókat egymás után, külön csövekben végezzük. Kiindulási anyagként vagy teljes RNS-t, vagy ritkábban
poli(A)+ RNS-t használunk, és oligo-dT primerekből,
random primerekből, oligo-dT primerek/random primerek keverékéből vagy génspecifikus primerekből fordított transzkriptáz enzim segítségével elongációval cDNS-t állítunk elő. E reakció egy aliquotját ezután hozzáadjuk a qPCR-hez.
Egylépéses RT-qPCR
Ha a reverz transzkripciós és qPCR-reakciókat egy csőben egyesítjük, a kísérleti beállítás egyszerűsödik
és kisebb a kontamináció esélye, mivel nem szükséges a minta további kezelése.
NcRNS-transzkriptek mennyiségi meghatározása és elemzése.
A legtöbb nem kódoló RNS hosszabb, mint 100 nukleotid, ezért RT-qPCR
segítségével kimutathatók és számszerűsíthetők ugyanazokkal a technikákkal, amelyeket az mRNS elemzéséhez használnak. Ezzel szemben a rövid nem kódoló RNS-ek, mint például a mikro- és piwi RNS-ek, lényegében egyetlen PCR-primer hosszának felelnek meg. Ennek következtében a qPCR elvégzése előtt olyan technikára van szükség, amely ezeket a rövid RNS-eket meghosszabbítja. A kereskedelmi forgalomban kapható rendszerekben két fő megközelítést alkalmaznak: 1) egy stemloop RT-primer használata és 2) poly-A tailing, amelyet egy oligo-dT adapterprimerrel végzett RT követ (3.2. ábra). A Casoldi et al. által kifejlesztett alternatív megközelítés, amely kereskedelmi forgalomban nem kapható, egy adapter molekula ligálását alkalmazza a minta összes RNS-éhez, és specifikus primertervezést a kívánt célpontok megkülönböztetésére1,2.
A stem-loop RT primer megközelítést az Applied Biosystems (jelenleg Life Technologies/Thermo) fejlesztette ki és hozta kereskedelmi forgalomba az ezt követő TaqMan szondán alapuló qPCR3 számára. Amint azt a 3.2A. ábra szemlélteti, az RT-primer 5'-végének bázispárja a saját 3'-végétől néhány nukleotiddal távolabb eső régióval képes bázispárosodni, hogy egy bázispárosodott szárat hozzon létre, amelyet egy párosítatlan hurok választ el. Az RT-primer 3'-végének utolsó néhány nukleotidját kivéve minden nukleotid univerzális, azaz minden miRNS-primerben ugyanazt a szekvenciát tartalmazza. Az utolsó néhány nukleotid, amely a szár 3'-ra nyúlik, komplementer a célzott miRNS 3'-végéhez. A primer meghosszabbítása a miRNS-templát mentén egy
cDNS-t hoz létre, amelyet egy miRNS-specifikus előre irányuló primerrel és egy univerzális hátrafelé irányuló primerrel lehet amplifikálni, ez utóbbi a szárhurok RT-primer 5'-végéhez komplementer
.
A többi kereskedelmi forgalomban kapható miRNS qPCR módszer, beleértve a mi MystiCq® márkánkat is, a miRNS meghosszabbításához poli-A farokkötést használ, ahogyan azt Shi és Chiang4 leírta. A poli(A)polimeráz (PAP), egy sablonfüggetlen enzim, katalizálja az adenozinmaradékok ATP-ből történő átvitelét bármely RNS 3'-végére. Amint azt a 3.2B ábra szemlélteti, az RT ezután oligo-dT primerrel végezhető. Az oligo-dT primer 5'-végén egy adapterszekvencia található, amely lehetővé teszi a későbbi qPCR-t egy specifikus miRNS-hez komplementer forward primerrel és egy az adapterszekvenciához komplementer reverse primerrel.
3.2. ábra.A miRNS RT és qPCR vizsgálatára két kereskedelmi forgalomban kapható módszer áll rendelkezésre. A) A miRNS 3' végére történő hibridizáció után egy hurkolt primert használnak az RT lépés alapozására. A hurokon keresztül történő PCR-hosszabbítás egy kombinált miRNS és univerzális szekvenciát eredményez, amely elég hosszú az amplifikációhoz B) A poli-A farok hozzáadása a miRNS-hez primerhelyet biztosít egy olyan primer számára, amely egy oligo-dT traktusból és egy univerzális primer szekvenciából áll. Nukleinsavkutatás az Oxford University Press által. Az Oxford University Press engedélyével, könyvben/e-könyvben történő újrafelhasználás formájában a Copyright Clearance Center-en keresztül sokszorosítva.
Mindkét kereskedelmi megközelítésnek vannak előnyei és hátrányai. A stem-loop priming 2 lépéses RT-qPCR-t tesz lehetővé, míg a legtöbb poly-A tailing módszer további RT lépést igényel a qPCR előtt. Léteznek olyan termékek, amelyek a poly-A tailinget és az RT-t egyetlen reakcióban kombinálják a 2 lépéses PAP tailing/RT-qPCR-hez. A kimutatás azonban kevésbé érzékeny lehet ezzel a megközelítéssel (nem publikált belső eredmények). Ezzel szemben a poli-A tailing és az azt követő RT stabil cDNS-poolt eredményez, amely bármely mikroRNS, mRNS vagy más RNS kimutatására használható, azonnal vagy bármikor a jövőben. A stem-loop/TaqMan megközelítéssel minden egyes miRNS kimutatásához más-más primerre van szükség. Több stem-loop primer adható ugyanahhoz az RT reakcióhoz5 és a Life Technologies-tól több miRNS-hez tartozó RT primer poolok vásárolhatók a multiplex RT elvégzéséhez. Azonban egyik lehetőség sem teszi lehetővé a később felfedezett miRNS-ek qPCR-detektálását, és nem teszi lehetővé a qPCR-t az azonos cDNS-ből származó mRNS kimutatására. A Castoldi és munkatársai1,2 által leírt rendszer egyedülálló abban a tekintetben, hogy lehetővé teszi az mRNS, a prekurzor és a teljesen feldolgozott miRNS molekulák kimutatását ugyanabból a teljes RNS-mintából.
qPCR követelmények
Instrumentumok
Néhány qPCR-műszert úgy terveztek, hogy egy adott alkalmazási területet támogasson, pl.g., állítsuk szembe az ABi 7900 nagy áteresztőképességű, 384 lyukú lemezek automatikus betöltését használó műszer képességeit az Illumina által gyártott és forgalmazott Eco műszerrel, amely egyetlen 48 lyukú lemezt támogat. Ezért a legmegfelelőbb műszer megfelel a kutatás igényeinek. Kívánatos olyan műszert választani, amely felhasználóbarát szoftverrel rendelkezik, amely elvégzi a legkívánatosabb funkciókat, és rugalmas az adatkimenet tekintetében, hogy az adatok könnyen kezelhetők legyenek a későbbi statisztikai elemző szoftvercsomagokban. Ez csökkenti a személyzet betanításához és így az eredmények előállításának megkezdéséhez szükséges időt. A további szükséges jellemzők közé tartozik egy olyan PCR-blokk, amely teljesen egységes (abszolút maximális eltérés 1 Cq = 2-szeres a 96 replikációs lyukban) és egy olyan optikai rendszer, amely a lehető legérzékenyebben és a lehető legegyenletesebben gerjeszti és detektálja az emissziót a hullámhosszok széles tartományában. Ez lehetővé teszi a fluoroforok széles választékát és a multiplexelést. További megfontolandó jellemzők az egyes fogyóeszközökkel kapcsolatos működési költségek, pl, ha a reakciókhoz nem szabványos mikrotiterlemezt használnak, valamint a nem szabványos formátumú lemezek/csövek betöltésének kényelme.
Sablon
A qPCR elindításához nagyon kevés célnukleinsav-kópiára van szükség (ami körülbelül 100 pg gDNS-nek vagy cDNS-nek felel meg). A reakciógátlókkal való szennyeződés minimalizálása érdekében a kiindulási templát mennyiségét a pontos mennyiségi meghatározás eléréséhez szükséges minimumon kell tartani. Ha a kiindulási anyag RNS, a primertervezés és a DNáz I kezelés csökkenti a gDNS-szennyeződésből származó jeleket.
Primerek
Függetlenül attól, hogy dsDNS-kötő festéket vagy szondán alapuló detektálási kémiát használunk, a qPCR egyik legkritikusabb kísérleti előtti lépése a kiváló minőségű primerek tervezése. Az assay-tervezés részletes tárgyalása PCR, qPCR, dPCR Assay Design. Az érzékenység és a specificitás maximalizálása érdekében minden szükséges módosítást, mint például a zárolt nukleinsav, be kell építeni (qPCR detektálási kémia).
Szonda(k)
Az amplikonok detektálására szolgáló szondák használata esetén a primer dimerek és a nem specifikus termékek nem detektálhatók, de kerülni kell őket, mert csökkenthetik a reakció hatékonyságát. Az érzékenység és a specificitás maximalizálása érdekében az alkalmazáshoz megfelelő szondatípust kell kiválasztani, és minden szükséges módosítást, mint például a Locked Nucleic Acid (qPCR detektálási kémia).
dNTP-k
A standard PCR és qPCR mesterkeverékek dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t tartalmaznak. Vannak azonban olyan keverékek, amelyek a dTTP-t dUTP-vel helyettesítik. A dUTP-vel futtatott korábbi reakciók termékei uracilt tartalmaznak timin helyett. Ezek azután hajlamosak az Uracil-DNS-glikoziláz (UNG) általi hasításra. Ezért a későbbi reakciók előzetes UNG-vel történő inkubálása megakadályozza a reakciók közötti átviteles szennyeződést. A hatékonyság érdekében a laboratóriumban minden PCR-nek dUTP-t kell használnia.
Magnézium
A magnézium-klorid (MgCl2) szükséges a reverz transzkriptáz, a Taq DNS-polimeráz és a Taq DNS 5' - 3' exonukleáz aktivitásához. A DLP-ket tartalmazó reakciók optimális Mg2+ koncentrációja általában 3-6 mM között van. A mesterkeverékek többsége tartalmaz MgCl2, azonban néha szükség van a koncentráció optimalizálására, ezért egy további cső tiszta MgCl2 általában a mesterkeverék termékhez mellékelik (lásd Assay-optimalizálás és validálás). Bizonyos esetekben olyan reakciómixre lehet szükség, amely nem tartalmaz MgCl2 -t, hogy alacsony koncentrációban lehessen használni, pl, a Scorpions® Probe detektálásakor.
Reverse transzkriptáz
Az RT-qPCR sikeréhez kritikus fontosságú egy olyan reverz transzkriptáz enzim, amely nagy cDNS-hozamot biztosít, miközben magas hőmérsékleten is megőrzi aktivitását. A magas hőmérsékleten nyújtott teljesítmény segít biztosítani, hogy az RNS jelentős másodlagos szerkezettel rendelkező régiói destabilizálódjanak és hozzáférhetővé váljanak a hibridizáció és az azt követő amplifikáció számára. Az egylépéses RTqPCR végrehajtása során a magas hőmérsékleten történő teljesítmény lehetővé teszi a magas olvadási hőmérsékletű (Tm) genspecifikus primerek használatát, ami növeli a reakcióspecifikusságot. Kétlépéses protokollok végrehajtásakor fontos annak biztosítása, hogy az enzim az RNS-ből lineáris és arányos cDNS-hozamot eredményezzen (lásd Reverse Transcription az RT-értékelés részleteiért).
Taq DNS-polimeráz
Az RT-hez legmegfelelőbb reverz transzkriptáz kiválasztásához hasonlóan a megfelelő polimeráz enzim kiválasztása is létfontosságú. A természetes Taq DNS-polimerázzal kapcsolatban alapvető probléma, hogy az enzimnek alacsony hőmérsékleten maradék aktivitása van. A nemspecifikus primer-kötés e maradék polimeráz-aktivitás következtében nemspecifikus termékképződéshez vezet. Az antitest-blokkolt vagy kémiailag blokkolt Taq DNS-polimerázok ("hot start") segítenek orvosolni ezt a helyzetet azáltal, hogy megakadályozzák az enzim aktivitását a magas hőmérsékletű denaturációs lépés kezdetéig.
Puffer
A pufferek vagy reakciómester keverékek, általában dNTP-ket, Taq DNS-polimerázt, MgCl2 és stabilizátorokat tartalmaznak. A SYBR Green I festék, ROX™, fluoreszcein és inert betöltő festékek is tartalmazhatnak (betöltő kontrollfestékek), a detektálási kémiától, a műszertől és a reakció követelményeitől függően. A PCR-pufferkomponensek és stabilizátorok jellemzően a gyártó sajátjai. Külön megvásárolva maximális rugalmasság érhető el, mivel minden egyes összetevő egyedileg optimalizálható a reakcióban. Ezzel szemben azonban, bár az összetevők mesterkeverékként történő együttes megvásárlása csökkenti a rugalmasságot, növeli a tételek konzisztenciáját és kényelmét, miközben csökkenti a pipettázási lépések számát, és ezáltal a hiba és a szennyeződés esélyét.
Betöltési ellenőrző festékek
Néhány valós idejű PCR termikus cikláló megköveteli, hogy minden egyes reakcióba betölthető legyen egy betöltő festék, például ROX, az optikai rendszer változékonyságának ellenőrzésére és a jelintenzitásbeli különbségek normalizálására. Hasonlóképpen, egyes termikus ciklálókban szükség van egy kezdeti fluoreszcein jelre, hogy virtuális hátteret hozzanak létre, amikor SYBR Green I festékpróbákkal dolgoznak (amelyeknek nagyon alacsony a háttere). Ezeket a mesterkeverékben vagy különálló komponensként lehet szállítani, hogy a megfelelő koncentráció használható legyen.
A MIQE irányelvek.
A qPCR alkalmazásával kapcsolatban az egyik egyértelmű probléma az, hogy nagyon könnyű olyan számokat előállítani, amelyek aztán könnyen kvantitatív eredményekként értelmezhetők. Ez azonban ugyanilyen félrevezető lehet, mivel minőségellenőrzésre és további elemzésre lehet szükség ahhoz, hogy megkülönböztessük a nem megfelelő próbatervezés, végrehajtás vagy adatelemzés által okozott potenciális artefaktumokat. A látszólag jelentős adatok megfelelő minőségellenőrzés nélküli közzététele olyan jelentésekhez vezetett, amelyek a legjobb esetben sem biológiai vagy klinikai szempontból nem relevánsak, a legrosszabb esetben pedig pontatlanok.
A qPCR kísérleti folyamat minden egyes lépése, a mintagyűjtéstől a qPCR-adatok elemzéséig, ki van téve a variabilitásnak6. Ezért a variabilitás előfordulhat a minta kiválasztása és feldolgozása, a nukleinsavak extrakciója (minőségi különbségeket eredményezhet, amelyek a qPCR célpontok kimutatásának reprodukálhatóságának hiányát okozzák), a próbatervezés és optimalizálás (hozzájárul a próbák hatékonyságának és érzékenységének különbségeihez) és az adatelemzés (némi szubjektív értelmezést és a megfelelő statisztikai módszerek alkalmazását igényli) során. Kritikus fontosságú, hogy a tudományos közönségnek nyújtott információk megfelelő információkat tartalmazzanak a kísérlet kritikus értékeléséhez7, mégis nyilvánvaló, hogy ez nem mindig van így8. A "Minimum Information for Publication of Quantitative Real-time PCR Experiments" (MIQE) iránymutatások9 foglalkoznak ezekkel az aggályokkal. A MIQE-irányelvek célja az átláthatóság növelése azáltal, hogy meghatározzák a vizsgálatra vonatkozó minimális információkat, amelyek szükségesek ahhoz, hogy az olvasó képes legyen értékelni a publikáció technikai érvényességét, valamint útmutatást nyújtanak az új qPCR-vizsgálatok tervezéséhez, optimalizálásához és validálásához.
A MIQE kilenc szakaszból áll (kísérleti tervezés, minta, nukleinsavak, reverz transzkripció, célpont, primerek és szondák, vizsgálati részletek, PCR-ciklus és adatelemzés; látogasson el a MIQE oldalunkra az ellenőrzőlista letöltéséhez, 1. táblázat). Minden paraméter olyan információkra vonatkozik, amelyeket a kísérlettervezés, optimalizálás és validálás során kell beszerezni. Kereskedelmi vagy a publikált irodalomból származó próbák használata esetén is el kell végezni az optimalizálást és a validálást. A MIQE-dokumentum tartalmaz egy ellenőrző listát, amelyben az Essential (nélkülözhetetlen) címkével ellátott tényezők szerepelnek, amelyeket nélkülözhetetlennek tartanak a qPCR-teszt megfelelő leírásához, míg más összetevők Desirable (kívánatos) címkével vannak ellátva, jelezve, hogy ez az információ hasznos, de anélkül is megismételhető a teszt, és a publikációban szereplő adatok kiértékelhetők. Fontos felismerni, hogy a PCR hatékonyságának, analitikai érzékenységének és specificitásának jelentése minden egyes vizsgálat esetében alapvető fontosságú, és azt a vizsgálónak kell meghatározni a laboratóriumi körülmények között. A digitális PCR elvégzésekor vannak speciális megfontolások (lásd Digital PCR), amelyekkel a digitális PCR MIQE közelmúltbeli kiadványa10 foglalkozik.
A MIQE-nek megfelel?
Minimális információk a kvantitatív valós idejű PCR-kísérletek közzétételéhez
aClinical chemical Copyright 2009 by American Association For Clinical Chemistry, Inc. Reprodukció az American Association For Clinical Chemistry, Inc. engedélyével, a Copyright Clearance center-en keresztül történő internetes közzététel formájában.
bMinden lényeges információt a kézirattal együtt kell benyújtani, A kívánatos információkat, ha rendelkezésre állnak, be kell nyújtani. Ha a primerek az RTPrimerDB-ből származnak, akkor a qPCR-célpontra, az oligonukleotidokra, a protokollokra és a validálásra vonatkozó információk elérhetőek ebből a forrásból.
cAz RNS első kivonásakor elengedhetetlen a DNS hiányának értékelése egy no-revers transzkripciós próbával. Miután a minta DNS-mentesnek bizonyult, a nem-reverz transzkripciós kontroll alkalmazása kívánatos, de már nem elengedhetetlen.
dA szonda szekvenciájának közzététele nagyon kívánatos és erősen ajánlott. Mivel azonban nem minden, nem kereskedelmi forgalomban kapható, előre megtervezett próbák szállítói biztosítják ezt az információt, ez nem lehet alapvető követelmény. Az ilyen próbák használata nem ajánlott.
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?